病毒核酸實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)步驟

具體操作如下：

1. 病毒采樣：取病人唾液或者鼻咽拭子于病毒采樣管保存

2. 　核酸提?。禾崛〔∪送僖夯蛘弑茄适米訕颖纠锏倪z傳物質(zhì)，如果病人攜帶病毒,，則樣本里就會(huì)有該病毒的遺傳物質(zhì)RNA,使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動(dòng)化儀器等商品化試劑或設(shè)備并按說(shuō)明書操作,。提取RNA時(shí)應(yīng)注意防止RNA降解,。DNA應(yīng)置于-20℃保存，RNA和需長(zhǎng)期保存的DNA應(yīng)置于-70℃或液氮保存,。

3.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:進(jìn)行提取液中RNA的逆轉(zhuǎn)錄,，把RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA

　　逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs,、逆轉(zhuǎn)錄酶,、RNA酶抑制劑,、DTT、緩沖液和適量無(wú)RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板,。在擴(kuò)增儀或水浴箱中,，在規(guī)定的溫度和時(shí)間下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。建議使用商品化RT-PCR一步法試劑進(jìn)行第一輪擴(kuò)增反應(yīng),。逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物,、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶,、RNA酶抑制劑,、DTT、緩沖液和適量無(wú)RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板,。在擴(kuò)增儀或水浴箱中,，在規(guī)定的溫度和時(shí)間下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用商品化RT-PCR一步法試劑進(jìn)行第一輪擴(kuò)增反應(yīng),。

3. PCR擴(kuò)增反應(yīng)（使用二次擴(kuò)增的套式PCR擴(kuò)增方法）:用病毒cDNA的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)需使用引物,、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）,、緩沖液,、和適量無(wú)RNA/DNA酶超純水、以及模板（DNA或cDNA）,。在擴(kuò)增儀中,，按照設(shè)定的程序進(jìn)行擴(kuò)增。使用二次擴(kuò)增的套式PCR擴(kuò)增方法,。

5. 結(jié)果分析判定：

若有擴(kuò)增出病毒的DNA條帶,，則判定病人體內(nèi)有該病毒

若沒(méi)有擴(kuò)增出DNA條帶，則判定病所取樣本無(wú)該病毒

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

①　每一次檢測(cè)需同時(shí)做兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照,、兩個(gè)陰性對(duì)照,，只有陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出預(yù)期的片段、陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出任何片段,、雙份平行樣品結(jié)果一致的情況下實(shí)驗(yàn)才成立,，可以作出核酸陽(yáng)性或陰性反應(yīng)結(jié)果的判定。

②　核酸檢測(cè)陽(yáng)性：發(fā)現(xiàn)核酸陽(yáng)性反應(yīng),，應(yīng)該重復(fù)采集樣品進(jìn)行復(fù)測(cè),，復(fù)測(cè)結(jié)果呈核酸陽(yáng)性反應(yīng)則判定為核酸陽(yáng)性，復(fù)測(cè)結(jié)果為核酸陰性反應(yīng)則判為不確定結(jié)果,，需進(jìn)一步隨訪檢測(cè),。

③　核酸檢測(cè)陰性：只可報(bào)告本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性。