NOX4 functions as a mitochondrial energetic sensor coupling cancer metabolic reprogramming to drug resistance Nat Commun. 2017 Oct 19;8(1):997. doi: 10.1038/s41467-017-01106-1 IF=12.124

背景

NOX4作為線粒體能量感應器，將腫瘤代謝重編程和治療耐藥聯(lián)系起來,。cancer metabolic reprogramming腫瘤代謝重編程,，是新近關于腫瘤代謝的新名詞，是指腫瘤細胞糖代謝主要以無氧糖酵解為主,，不同于正常細胞有氧氧化磷酸化的產生ATP的高效率（32個ATP）,，無氧糖酵解只能產生少量的ATP（2個）和產生大量乳酸，消耗大量能量,。不明白為什么腫瘤細胞采取效率更低下的無氧糖酵解,，只好給它命名warburg效應。

沃伯格效應(Warburg effect) 是由德國生物化學家奧托·沃伯格(Otto Warburg,1883～1970）于1930年發(fā)現的,。腫瘤細胞產生能量的方式極為特別: 健康細胞依靠線粒體氧化糖類分子釋放出有用的能量, 而大多數腫瘤細胞則通過通過產能率相對較低糖酵解作用為自身供能,。這種作用機制不需要氧氣也不需要線粒體參與。惡性,，生長迅速的腫瘤細胞通常的糖酵解率比他們的正常組織高達200倍,。這種情況，即使在氧氣充足的條件下也會發(fā)生,。奧托華寶推測這種變化的代謝是癌癥的根本原因,。

warburg效應示意圖：正常組織在有氧條件下都通過線粒體的氧化磷酸化代謝葡萄糖，而腫瘤細胞和增生較快速的組織,，即使在有氧的條件下,，也通過糖酵解的方式代謝，產生大量乳酸和少量ATP,。

NOX4,，作為NADPH氧化酶（一種ATP-biding motif） 內一個亞基，論文結果顯示當ATP與motif結合的時候,，會影響NOX4的活性,。那么NOX4的功能是什么？它是如何影響化療耐藥的呢,？

線粒體內NOX4可以產生ROS,，無氧糖酵解產生大量活性氧自由基（ROS），ROS會影響腫瘤細胞的增生和凋亡,。調節(jié)NOX4上下游的位點需要進一步研究,。

NOX4的耐藥表型實驗：NOX4是否調節(jié)化療耐藥？

細胞模型：renal cell carcinoma腎細胞癌,，腎癌多由于von Hippel–Lindau (VHL) 基因的突變缺失所致,。腎癌對化療藥物非常不敏感，天然的耐藥細胞模型。

786-O腎癌模型,，stably transfected with shVector and shNOX4,，利用shNOX敲減細胞模型內NOX4的表達水平。

A498腎癌模型,，transiently transfected with Scr and siNOX4,，瞬時抑制NOX4表達水平。

檢測方法：上述細胞模型給予依托泊苷藥物處理后,，檢測細胞凋亡情況,，細胞凋亡的檢測Annexin V staning、細胞流式儀,、western檢測cleaved PRAP（PARP又是細胞凋亡核心成員胱天蛋白酶(caspase)的切割底物）,。

抑制細胞內NOX4后，細胞凋亡比率明顯升高,，同時裂解的PARP也增多,，提示凋亡增多。癌細胞內NOX4活性較高,，對依托泊苷耐藥,。

除此之外，還對下述問題進行簡答：

1,、是線粒體內的NOX4導致的耐藥嗎,？NOX4在內質網、細胞核和細胞膜都有定位,，到底是哪兒的NOX4介導的耐藥,。

專門針對線粒體NOX4的干擾方法：利用mitotempol藥物處理細胞，專門清除掉線粒體超氧化酶,，包括NOX4,。然后在檢測依托泊苷處理細胞后凋亡情況。

2,、線粒體內ATP水平會影響耐藥嗎,？因為之前結果顯示ATP增多會抑制NOX4活性。

調節(jié)線粒體內ATP的方法：786-O培養(yǎng)液中加入半乳糖會增加線粒體內ATP,；VHL轉染缺失VHL的腎癌細胞會增加其線粒體內的ATP水平,。

3、NOX4在ATP介導的耐藥過程中是充分必要條件嗎,？whether NOX4 is neccesary and sufficient to mediated drug Resistance,。

設計突變的NOX4，使得ATP不能與其結合,，觀察ATP對耐藥的影響,。與雙熒光素酶實驗異曲同工,。

動物實驗驗證NOX4的耐藥表型：動物水平NOX4是否導致耐藥？

動物模型：裸鼠移植瘤模型,，上述細胞水平的細胞模型,，注射與裸鼠皮下，成瘤后,，給予依托泊苷化療,，觀察瘤體體積的變化,。

786-O轉染shVector的細胞注射于裸鼠左側腹部皮下,，5周后成瘤，測量體積,。

786-O轉染shNOX4的細胞注射于裸鼠右側腹部皮下,，……。

檢測方法：成瘤模型成功后,，給予依托泊苷化療4天,，每天測量瘤體體積共8天。以8天的體積比上化療前體積,，作為最后顯示數值,。同時為了驗證主要是因為凋亡增加，而不是增生減弱,，還檢測的凋亡指標：cleaved PRAP（western）和cleaved caspase-3（免疫組化）,。

a圖顯示抑制NOX4后腫瘤體積不再增加，b和C檢測了凋亡相關指標cleaved PRAP和caspase-3,。動物實驗水平證實NOX4影響化療耐藥,。

人體水平是否有證據：NOX4導致耐藥？

取腎癌組織和周圍正常組織,，分離線粒體,，檢測線粒體內NOX4表達水平，腎癌組織與正常組織相比,，NOX4表達升高,。

共取了4例腎癌和周圍正常組織，檢測其線粒體內NOX4,，癌組織線粒體中NOX4明顯增高,。

細胞模型（ex vivo實驗）：腎癌原代細胞模型，取腎癌組織,，分離原代細胞進行培養(yǎng),，然后利用siNOX4瞬時抑制細胞內NOX4表達水平。給予多柔比星后,，測定細胞凋亡情況,。

3例腎癌患者癌細胞原代培養(yǎng)，siRNA干擾NOX4后，給予多柔比星,，觀察細胞凋亡,。注意分組情況，四組,。

NOX4調節(jié)耐藥的下游靶基因,，深入分子機制

PKM2：丙酮酸激酶2，參與糖酵解的最后一步,，既往顯示其與腫瘤細胞的生長和凋亡相關,。推測PKM2可能為NOX4調節(jié)的靶基因。

1,、PKM2是否調節(jié)藥物治療敏感性：siPKM2抑制786-O和A498細胞PKM2,，細胞對化療藥物誘導的凋亡增加，assembly shNOX4,。

2,、PKM2是否被NOX4調節(jié)：PKM2表達在shNOX4抑制NOX4后，明顯降低,。

3,、NOX4是否通過抑制PKM2的乙酰化,，保護PKM2被降解：背景PKM2常常被乙?；缓笕苊阁w吞噬消化乙?；腜KM2,。shNOX4抑制786-O細胞后，檢測PKM2乙?；癄顟B(tài),，乙酰化的PKM2明顯增多,，乙?；腜KM2可以通過乙酰化抗體檢測,。

4,、PKM2是否是被溶酶體吞噬消化降解：采用溶酶體降解抑制劑3-M抑制細胞內溶酶體降解通路，觀察PKM2被降解減少,，殘留PKM2增多,。

5、溶酶體降解既然參與PKM2的降解,，且PKM2是調節(jié)化療藥物的敏感性,，那么溶酶體通路是否會影響到化療耐藥呢,？shNOX4的786-O細胞對依托泊苷藥物敏感，但是如果用3-M抑制溶酶體降解通路后,，其對依托泊苷敏感性明顯下降,。（因為PKM2滯留）

6、PKM2被乙?；窹ACF在K350位點乙?；缓蟊蝗苊阁w降解,。那么乙?；窹ACF是否影響腎癌細胞的化療耐藥: a、 siPACF干擾786-O細胞PACF的表達,，給予依托泊苷后,，檢測細胞凋亡變化，凋亡減少,，出現耐藥，且檢測細胞內PKM2表達增高,。b,、突變PACF乙酰化位點K450R（賴氨酸-精氨酸）,，乙?；窹ACF不能發(fā)揮作用，shNOX4的786-O細胞,，對依托泊苷敏感性增強,，當轉染PKM-K350R，對藥物敏感性恢復耐藥,。

線粒體NOX4被ATP調節(jié)：NOX4的上游通路

我會怎么做：將細胞模型與或不與ATP共培養(yǎng),，觀察線粒體NOX4功能變化，其中線粒體NOX4生物功能為產生ROS,，那么檢測加不加ATP后ROS的產生量,，即可驗證ATP調控NOX4。

作者1,、明確NOX4定位在線粒體,、2、線粒體有脂質體雙層膜,，NOX4是位于內膜還是外模,、3、NOX4是否影響ROS的產生,、4,、最后才是ATP是否影響ROS的產生,。

線粒體NOX4是能量代謝的感受器：

如何將細胞內ATP含量、NOX4活性和ROS聯(lián)系起來,？癌細胞由于wanburg效應,，采用細胞漿內糖酵解的能量代謝方式，而不是采用在線粒體內氧化磷酸化,，由于產能較低,，細胞內ATP水平下降，線粒體內NOX4感受不到ATP的刺激,，活性增強,，ROS產生增多。而NOX4活性增強,，會保護PKM2被溶酶體降解,，最終PKM2抑制細胞凋亡，導致藥物耐藥,。

示意圖最終解釋所有實驗內容,。