最近偶然看到一篇生信建模的文章,，思路清奇，讓人茅塞頓開,。

從標(biāo)題上來看 是一篇分析胰腺癌甲基化異常的 基因的預(yù)后signature,，這個(gè)題材的文章 看個(gè)標(biāo)題就差不多能猜出來干了什么事，但好奇的我感覺發(fā)五分應(yīng)該是有什么特別之處,，于是仔細(xì)的看了一下,，與大家分享。

本文整體思路簡(jiǎn)單鋝了鋝,，大概如下：

1,、下載ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)的甲基化數(shù)據(jù)和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的RNAseq數(shù)據(jù)

2,、分別篩選差異甲基化位點(diǎn)和差異基因

3,、緊接著 使用GEO的表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE21501進(jìn)行驗(yàn)證,，驗(yàn)證這些種子基因的差異表達(dá)

4、將甲基化差異結(jié)果和基因表達(dá)差異結(jié)果關(guān)聯(lián),，選擇差異上調(diào)的基因并且啟動(dòng)子區(qū)域甲基化下調(diào)的基因和差異下調(diào)的基因并且啟動(dòng)子區(qū)域甲基化上調(diào)的基因作為候選基因（此步相似文章看這里：https://www.ncbi.nlm./pmc/articles/PMC5545832/）

5,、對(duì)候選基因分別進(jìn)行單因素生存分析（開始進(jìn)一步找和預(yù)后相關(guān)的基因）

6、然后進(jìn)一步使用lasso回歸進(jìn)行特征選擇和構(gòu)建預(yù)后模型

7,、用驗(yàn)證數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證

8,、分析模型在不同的臨床分期中的預(yù)后預(yù)測(cè)效率

9、和已有的signature模型進(jìn)行比較說明模型優(yōu)勢(shì)

10,、功能富集分析模型中基因的功能

下面我們來看一下細(xì)節(jié)：

1,、數(shù)據(jù)下載

從ICGC上下載DNA甲基化數(shù)據(jù)（https://www./research/cancer/pancreatic-cancer-research/）。

從TCGA上下載RNAseq數(shù)據(jù)（https://cancergenome./）及臨床隨訪信息

從GEO上下載兩個(gè)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)（GSE21501和GSE62452）（https://www.ncbi.nlm./geo/query/acc.cgi?acc=GSE21501,，https://www.ncbi.nlm./geo/query/acc.cgi?acc=GSE62452）及對(duì)應(yīng)的臨床隨訪信息,。

2、差異分析

作者使用R軟件包limma進(jìn)行差異篩選,，選擇閾值FDR<0.01作為閾值,，最終得到了9227 個(gè)差異表達(dá)的基因（圖1A），進(jìn)一步與ICGC的甲基化譜進(jìn)行整合分析,，確定了81個(gè)下調(diào)基因,，這些基因是高甲基化的（81 / 480,16.9％）（圖1B）和1287個(gè)低甲基化的上調(diào)基因（1287 / 847,44.7）（圖1C）

疑問有三個(gè)：
1、方法學(xué)部分說用TCGA RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,，利用GSE21501數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證,，而這里結(jié)果只有GSE21501數(shù)據(jù)集的
2、FC>1 這個(gè)閾值是否太寬松了
3,、甲基化的差異和基因表達(dá)差異用的樣本不是同一個(gè),，準(zhǔn)確來說：樣本膚色都不一定一致，這里 推導(dǎo)出 受甲基化影響的基因表達(dá) 是不是有點(diǎn)遠(yuǎn),。
以上 真的可以這么來嗎

3,、單因素生存分析

作者使用單因素cox分別對(duì)第二步中得到的1368個(gè)候選基因進(jìn)行生存分析，選擇p值小于0.05作為閾值,，最終得到了三個(gè)基因：SULT1E1,、IGF2BP3、MAP4K4,。利用數(shù)據(jù)集GSE62452觀察這三個(gè)基因在癌與癌旁中的表達(dá)差異

疑問：
1268個(gè)候選基因只有這三個(gè)基因的預(yù)后差異的嗎,？
為什么只得到了這三個(gè)基因呢

4、使用lasso回歸對(duì)這三個(gè)基因構(gòu)建預(yù)后模型：risk score=0.195 * of SULT1E1+ 0.129 * of IGF2BP3 + 0.65 * of MAP4K4,；并分別在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證驗(yàn)證,。

利用預(yù)后模型 分別將訓(xùn)練集和驗(yàn)證集數(shù)據(jù)代入模型計(jì)算樣本的風(fēng)險(xiǎn)得分，再使用風(fēng)險(xiǎn)得分進(jìn)行單因素和多因素生存分析，同時(shí)比較TNM分期在這三套數(shù)據(jù)集中的單因素和多因素生存分析結(jié)果,，最終結(jié)果如Table1,從中可以看出模型在三套數(shù)據(jù)集中單因素和多因素都具有顯著差異,，同時(shí)與臨床分期相比更顯著

作者進(jìn)一步根據(jù)樣本風(fēng)險(xiǎn)得分將樣本平均分成高低兩組，觀察兩組的預(yù)后差異,，如圖,，從中可以看出三套數(shù)據(jù)集中也具有顯著的預(yù)后差異

6、分層分析,，觀察模型在不同的臨床分期中的預(yù)測(cè)效果

作者根據(jù)樣本的臨床TNM分期,，分別將不同的分期樣本單獨(dú)拿出來使用模型去預(yù)后高低風(fēng)險(xiǎn)樣本，結(jié)果如Table2所示,，從中可以看出在多數(shù)臨床分期中分類具有顯著的差異,，并且在T3/T4類型的樣本中分類效果最好

7、與已知的模型進(jìn)行比較

作者選擇了一個(gè)已經(jīng)發(fā)表的利用TCGA的基因表達(dá)數(shù)據(jù)篩選的基因模型,，分別比較了他們的1年,、3年、5年的ROC,，證明作者的模型線下面積最大,，完勝他們。

疑問：

選一個(gè)兩三分的文章的模型來比較來說明你的模型好,，這是啥意思呢

8,、功能富集

作者分別計(jì)算了這三個(gè)基因與基因組中其他基因的表達(dá)關(guān)系，選擇最顯著的前200個(gè)基因使用在線工具M(jìn)etascape (http:///)進(jìn)行功能富集分析,，發(fā)現(xiàn)最顯著的前三個(gè)生物學(xué)途徑是 Rho GTPases, chromosome segregation and focal adhesion pathways,，已有報(bào)道表明這三個(gè)通路均參與腫瘤進(jìn)展，為進(jìn)一步研究胰腺癌的三基因模型的詳細(xì)分子機(jī)制提供了依據(jù),。

以上便是文章的全部,，總的來說 文章很多細(xì)節(jié)沒有展示出來，有一種 欲蓋彌彰的感覺,，不過整個(gè)思路還是值得學(xué)習(xí)的,。