提到lncRNA,、circRNA,，大家最先想到的研究熱點(diǎn)是什么？lncRNA的cis,、trans,？還是circRNA的ceRNA？事實(shí)上,，兩種非編碼RNA（ncRNA）的另一種共有屬性還未被廣泛發(fā)現(xiàn),，那就是“編碼”！

一,、非編碼RNA"編碼"概況

 

納尼,？非編碼還能編碼，這是什么新特性,！確實(shí),，根據(jù)許多標(biāo)準(zhǔn)，它們不太可能編碼功能蛋白,。這些標(biāo)準(zhǔn)包括缺乏長(zhǎng)的ORF,，缺乏氨基酸序列保守性和缺乏已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域1。由于技術(shù)手段受限,，長(zhǎng)久以來(lái),，人們忽視了這些分子編碼的短肽對(duì)生命活動(dòng)的影響。

得益于分子技術(shù)的發(fā)展,，Orera2等分析了六種生物的核糖體譜數(shù)據(jù),，發(fā)現(xiàn)lncRNA與核糖體關(guān)聯(lián)達(dá)到30-82％（編碼為>92%），預(yù)示著lncRNA存在較大的編碼潛力,；Ariel3等人運(yùn)用核糖體足跡技術(shù)鑒定出人和斑馬魚(yú)表達(dá)的數(shù)百個(gè)短的閱讀框（short ORFs）sORFs,；pncr003:2L編碼兩個(gè)短肽，調(diào)節(jié)果蠅的心臟收縮4,；人MRI-2（69個(gè)氨基酸）刺激DNA雙鏈斷裂連接5,；人lncRNA-HOXB-AS3可編碼長(zhǎng)約53位氨基酸的短肽，該短肽而非lncRNA可抑制結(jié)腸癌的發(fā)生6,。

環(huán)狀RNA（circRNA）,，同樣具有編碼短肽的功能。不同于mRNA,、lncRNA具有5端帽子,，3端polyA尾結(jié)構(gòu)，circRNA為閉環(huán)的RNA分子,，其翻譯特性由m6A或者IRES（招募核糖體功能）驅(qū)動(dòng),。根據(jù)circRNADb收錄的數(shù)據(jù)，32914條環(huán)狀RNA,，預(yù)測(cè)編碼超過(guò)100個(gè)氨基酸的達(dá)16328條,，存在IRES的達(dá)7170條，表明很多環(huán)狀RNA也存在編碼短肽的能力：Circ-FBXW7表達(dá)185aa的短肽與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表型相關(guān)7,；circ-SHPRH表達(dá)146aa的短肽可起到抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生8,；circ-ZNF609編碼的短肽可控制成肌細(xì)胞的增殖9。

一系列的報(bào)道預(yù)示著,，sORFs是一片藍(lán)海有待發(fā)掘,。那么，如何研究ncRNA的編碼特性呢,？我們以HOXB-AS3(NCBI登錄號(hào)NR_033201)為例為您詳解lncRNA-sORF的預(yù)測(cè)及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程,。

二、lncRNA-sORF預(yù)測(cè)

 

1. ORF預(yù)測(cè)

大部分lncRNA編碼的肽段較短,、或者一條長(zhǎng)鏈里面包含多個(gè)ORF,，優(yōu)先選擇ORF較長(zhǎng)的研究。打開(kāi)orffinder預(yù)測(cè)網(wǎng)站（點(diǎn)擊可進(jìn)入）,，輸入登錄號(hào)ID或者序列,，其他參數(shù)默認(rèn)（參考已發(fā)現(xiàn)最小的短肽，目前預(yù)測(cè)短肽的最小值是24aa）,，點(diǎn)擊“submit”,，可看到兩條預(yù)測(cè)結(jié)果：

注意只看“strand”為“+”的結(jié)果，因?yàn)镽NA是單鏈的,，編碼區(qū)不會(huì)存在負(fù)義鏈上,。網(wǎng)站預(yù)測(cè)到HOXB-AS3存在兩個(gè)短肽，分別為53,、40個(gè)氨基酸,，接下來(lái)就是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

針對(duì)預(yù)測(cè)的短肽是否編碼,，常規(guī)是構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體并在ORF的C端添加標(biāo)簽(熒光或者WB標(biāo)簽),，并需要將翻譯起始位點(diǎn)ATG進(jìn)行突變，以確認(rèn)翻譯的起始位點(diǎn),。具體操作如下：

方法一：針對(duì)較長(zhǎng)的肽,，可采取融合flag直接進(jìn)行WB，直接將flag插入在全長(zhǎng)lncRNA的ORF末端,，并設(shè)計(jì)ATG突變作為對(duì)照（文章還設(shè)計(jì)了只構(gòu)建編碼區(qū)作為陽(yáng)參）,，隨后進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)即可,。

方法二：針對(duì)短肽，若WB靈敏度不足以檢測(cè)到,，那么采取短肽融合熒光策略較優(yōu),。方法類似，后續(xù)通過(guò)熒光的表達(dá)即可確認(rèn)肽是否編碼,。

三,、circRNA預(yù)測(cè)

 

得益于circRNADb數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)收錄的circRNA進(jìn)行了較多的注釋，circRNA可以直接查詢網(wǎng)站統(tǒng)計(jì)好的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù),。以FBXW7（hsa_circ_0001451）為例,，直接在circrnadb數(shù)據(jù)庫(kù)查找FBXW7名稱，找到對(duì)應(yīng)的circRNA（在circrnadb的ID是hsa_circ_16502）,，可以獲得數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的IRES（也可以用IRESfinder預(yù)測(cè)）以及ORF區(qū)（同樣可以用ORFfinder預(yù)測(cè),，但是要將序列成環(huán)延伸變?yōu)榫€性再進(jìn)行預(yù)測(cè)）：

接下來(lái)仿照l(shuí)ncRNA的做法，在ORF末端加上標(biāo)簽,，進(jìn)行密碼子ATG突變,，以及IRES缺失構(gòu)建環(huán)狀RNA過(guò)表達(dá)，進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證：

非編碼RNA通常轉(zhuǎn)錄活性較低,，且由于較短的ORF,，同于早前認(rèn)為lncRNA是轉(zhuǎn)錄垃圾，一些科研人員認(rèn)為大部分短肽是無(wú)功能的翻譯垃圾,。然而研究發(fā)現(xiàn)：多數(shù)人類特異性編碼基因是從獼猴或黑猩猩低表達(dá)的非編碼RNA進(jìn)化而來(lái)10,，這表示在選擇壓力下，ncRNA編碼的肽可作為物種進(jìn)化時(shí)新肽的重要來(lái)源2,，至于ncRNA表達(dá)的肽是否具有更加廣泛的生物學(xué)意義,，還待更多的科學(xué)研究！??！

【參考文獻(xiàn)】

1.GENCODE: the reference human genome annotation for The ENCODE Project；

2.Long non-coding RNAs as a source of new peptides,；

3.Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation,；

4.Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames；

5.A human short open reading frame (sORF)-encoded polypeptide that stimulates DNA end joining,；

6.A Peptide Encoded by a Putative lncRNA HOXB-AS3 Suppresses Colon Cancer Growth,；

7.Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis；

8.A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis,；

9.Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis,；

10.Hominoid-Specific De Novo Protein-Coding Genes Originating from Long Non-Coding RNAs.

 

吉?jiǎng)P基因，年產(chǎn)上萬(wàn)次慢病毒,、腺病毒,、腺相關(guān)病毒,；
建有國(guó)內(nèi)大型的慢病毒文庫(kù)，包含幾乎覆蓋人類所有基因的,，近 15 萬(wàn)個(gè)獨(dú)立克??；
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