fastp是最近新出的一款NGS數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾工具,，相比傳統(tǒng)的QC工具,，有兩個主要特點(diǎn)，第一個就是運(yùn)行速度快,，第二個就是提供了質(zhì)控前后數(shù)據(jù)詳細(xì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果,。github地址如下

https://github.com/OpenGene/fastp

安裝過程如下

無論是單端測序，還是雙端數(shù)據(jù),，fastp都支持,。對于單端數(shù)據(jù)，用-i參數(shù)指定輸入的序列文件,，-o參數(shù)指定輸出的序列文件,；對于雙端數(shù)據(jù),，用-i和-I分別指定R1端和R2端的序列。

該軟件可以對數(shù)據(jù)進(jìn)行以下幾種過濾

1. 去除adapter 序列

默認(rèn)情況下,，該軟件會自動查找序列中的adapter序列并去除,，對于單端測序數(shù)據(jù)，根據(jù)起始的1M左右的reads來預(yù)測adapter序列,；對于雙端測序數(shù)據(jù),，根據(jù)overlap部分的reads來推測adapter序列，雖然自動化預(yù)測對于使用者而言比較方便省心,，但是預(yù)測的adaper序列可能不太準(zhǔn)確,，實(shí)際使用時(shí)，建議還是自己手動指定具體的adapter序列,。

單端數(shù)據(jù),，通過--adapter_sequence指定adapter序列；對于雙端數(shù)據(jù),，通過--adapter_sequence和--adapter_sequence_r2指定adapter序列,。當(dāng)手動指定adapter序列時(shí)，軟件就不會自動檢測了,，而是按照指定的adapter序列進(jìn)行查找和過濾,。

如果不希望進(jìn)行去除adapter序列這一步，可以添加-A或者--disable_adapter_trimming參數(shù),，這樣軟件就不會去除adapter序列了,。

2. 過濾低質(zhì)量的序列

默認(rèn)情況下，會過濾掉質(zhì)量較差的序列,，-q參數(shù)指定堿基質(zhì)量的閾值,，小于該質(zhì)量的堿基被認(rèn)為是低質(zhì)量的堿基，-u參數(shù)指定一條序列中允許的低質(zhì)量堿基的百分比,，取值范圍從0-100,，如果序列中低質(zhì)量堿基百分比超過了該閾值，這條序列就會被過濾掉,；-n參數(shù)指定一條序列中最多允許的N堿基的個數(shù),，如果超過這個數(shù)值，這條序列會被過濾掉,。

如果不希望過濾掉低質(zhì)量序列,，可以添加-Q參數(shù)。

3. 根據(jù)序列長度進(jìn)行過濾

默認(rèn)情況下,，該軟件會根據(jù)長度對序列進(jìn)行過濾,，--length_required指定最小長度，小于該長度的reads會被過濾掉;--length_limit指定最大長度,，大于該長度的reads也會被過濾掉,，如果不希望進(jìn)行長度過濾,，可以添加-L或者--disable_length_filtering參數(shù)。

4. 去除低質(zhì)量的堿基

fastp支持類似trimmomatic滑動窗口的方式,，對序列中的低質(zhì)量堿基進(jìn)行過濾,，但是它的算法運(yùn)行速度更快。-W參數(shù)定義滑動窗口的長度,，默認(rèn)值為4，-M參數(shù)定義堿基平均質(zhì)量的閾值,，默認(rèn)值為20,。如果一個窗口內(nèi)堿基平均質(zhì)量低于20，該窗口及其之后的堿基都會被過濾掉,。

默認(rèn)情況下,，是不會去除低質(zhì)量堿基的，添加-3參數(shù)可以利用滑動窗口的方式從reads的3’端去除低質(zhì)量的堿基,。

5. 去除reads兩端的部分堿基

fastp支持從reads的3’端和5’端去除固定個數(shù)的堿基,，對于單端數(shù)據(jù)，-f指定從5’端去除的堿基數(shù),，-t指定從3’端去除的堿基數(shù),；對于雙端數(shù)據(jù)，用-f和-F參數(shù)分別指定R1序列5’端去除的堿基數(shù),，用-t和-T參數(shù)分別指定R2序列3’端去除的堿基數(shù),。

6. 去除polyG/polyX

fastp支持去除序列3’端的尾巴，只有對于NextSeq/NovsSeq的數(shù)據(jù),，fastp會自動去除polyG尾,，--poly_g_min_len指定ployG的最小長度，-g參數(shù)強(qiáng)制對所有數(shù)據(jù)去除polyG尾,，-G參數(shù)禁止去除polyG尾,。默認(rèn)情況下，fastp不會去除polyX尾,，可以添加-X參數(shù),，同時(shí)使用--poly_x_min_len指定polyX的最小長度，默認(rèn)值都為10,。

7. 過濾掉低復(fù)雜度的序列

fastp支持根據(jù)復(fù)雜度對序列進(jìn)行過濾,，序列復(fù)雜度定義如下

依次比較前后相連的兩個堿基，統(tǒng)計(jì)前后堿基不同的次數(shù),，這個次數(shù)作為分母,，對于上述的例子而言，就是3,，分子是序列長度減一,，二者的商就是序列負(fù)責(zé)度,。

默認(rèn)情況下，是不會根據(jù)序列復(fù)雜度進(jìn)行過濾的,，如果想要進(jìn)行過濾,，需要添加-Y參數(shù)，同時(shí)使用-y參數(shù)指定復(fù)雜度的閾值,，取值范圍0-100,， 默認(rèn)值為30，復(fù)雜度低于30%的序列會被過濾掉,。

8. 根據(jù)index 對序列進(jìn)行過濾

fastp支持根據(jù)index對序列進(jìn)行過濾,， --filter_by_index1參數(shù)指定一個index文件，該文件中每行是一個index,，如果序列的index在該文件中,，這條序列會被過濾掉，--filter_by_index_threshold參數(shù)指定實(shí)際index序列與檢測到的index序列之間的最大錯配數(shù),。

9. 對雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行校正

通常情況下,，reads的3’端質(zhì)量較差，雙端測序的數(shù)據(jù),，可以根據(jù)overlap部分的序列,，對低質(zhì)量的測序結(jié)果進(jìn)行校正。通過添加-c參數(shù),，fastp可以校正雙端測序的結(jié)果,，--overlap_len_require參數(shù)指定overlap的最小堿基數(shù)，--overlap_diff_limit指定overlap區(qū)域允許的最大錯配數(shù),。

10. UMI 預(yù)處理

由于文件構(gòu)建過程中,，存在PCR的過程， 會影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性,，最近出現(xiàn)了UMI這樣的技術(shù),，本質(zhì)上對未擴(kuò)增之前的片段進(jìn)行標(biāo)記，建庫之后,，擁有相同UMI標(biāo)記的reads來自于同一份模板,，在數(shù)據(jù)分析時(shí)，可以依據(jù)這個標(biāo)記對序列去冗余,，使定量的結(jié)果更加準(zhǔn)確,。

fastp支持對UMI標(biāo)記的序列進(jìn)行預(yù)處理，添加-U參數(shù)之后,，fastp就可以對UMI數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,。--umi_loc指定umi 的index 出現(xiàn)的位置，--umi_len指定umi index的長度。

11. 分析過表達(dá)序列

在reads中存在的過表達(dá)序列可能是adapter序列,，分析過表達(dá)序列有助于我們發(fā)現(xiàn)測序和建庫中可能出現(xiàn)的問題,，通過添加-p參數(shù)可以使fastp進(jìn)行過表達(dá)序列的分析。

在以上所有操作中,，前3步默認(rèn)都會執(zhí)行,，其他操作可以根據(jù)個人需要，進(jìn)行添加,。fastp支持多線程,，通過-w參數(shù)指定并行的線程數(shù)。

除了輸出質(zhì)控后的clean reads外,，fastp還可以輸出json和html兩種格式的報(bào)告文件,，-j指定json格式的報(bào)告文件，-h指定html格式的報(bào)告文件,。

fastp的基本用法如下，單端數(shù)據(jù)

雙端數(shù)據(jù)

在報(bào)告文件中,，會給出QC前后的序列統(tǒng)計(jì)信息, json文件示例如下

fastp的質(zhì)量過濾功能更加的豐富,，速度更快，而且報(bào)告文件給出的統(tǒng)計(jì)信息詳盡有用,，可以算得上是最強(qiáng)大的質(zhì)控軟件了,。