16S rDNA測序結果分析

追著天使拔毛 2019-10-09

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2017-12-13

1.測序結果文件

一般公司DNA測序結果都提供兩個文檔，一個是序列文檔(后綴為.seq),，一個是測序峰圖文檔(后綴.ab1),，為堿基的測序質量信息。
(A).seq – 序列文件,，TEXT的序列文檔，可由記事本或BioEdit打開,。
(B).ab1－峰圖文件,，可由BioEdit或Chromas打開察看。

2.切除兩端低質量堿基

由于Sanger測序技術限制,，每個測序反應一般僅有800bp左右比較準確,。
一般測序結果的前端大約50個堿基的質量會不好(測序引物的原因)，此部分測序峰圖通常無法判讀,。這是正?，F(xiàn)象，需要把此部分堿基切除。同理,，測序后期的堿基質量也比較差(酶活降低與雜質干擾較大等原因),，也需要把尾部測序峰圖不規(guī)則的堿基切除。因此留下中間堿基質量相對較好(峰圖規(guī)則)的序列用于后續(xù)分析,。方法如下：

用 BioEdit 打開正向測序結果峰圖文件( ZB10100433 (yangpin1) 16SS(zidai)_Pw_G12.ab1),通過移動左邊與左上角的比例標尺,，調整峰圖的高度與寬度，使DNA每個堿基的峰圖大小適合觀察,。
從下圖看出,，前面50多個堿基的峰較亂，此處選擇55個開始的堿基,。同理,，DNA末端由于酶活力下降等原因，測序質量也逐步變差,。根據峰圖的形狀,，我們也需要切除尾部950bp后的堿基（約末端100bp），只保留56-950之間約900bp的高質量堿基,。
選擇 BioEdit 顯示DNA序列的子窗口(Window菜單->DNA sequence frome…)
然后在 BioEdit 的Sequence菜單->select positions,在彈出窗口中輸入56與950,，點OK按鈕后，就以背景黑的顯示已選擇的序列,。
再選edit菜單->Copy(或直接按Ctrl-C鍵),，復制序列到一個新的文本文件，保存為16S_rDNA.fas,。增加序列的注釋行”>16SF”,代表正向測序序列,。
同上步驟，根據峰圖信息,，再復制另一個反向測序結果的高質量序列(56-950)到文本文件16S_rDNA.fas,，并標記序列為”>16SR”，代表反向測序序列,。
DNA測序通常需要兩個方向進行,，測序都是從DNA的5’端到3’端進行的，正向和反向測序是指對DNA的兩條互補鏈分別測序,。雙向測序結果經校讀后完全一致才能認為得到可靠DNA測序結果,。

3.雙向測序序列的合并

通常PCR產物雙向測序，需要合并雙向序列,，最終得到全長序列,，這樣得到DNA序列比較準確。

Bioedit打開前面保存的16S_rDNA.fas,。
由于第二條序列是反向測序得到的DNA反向互補序列,，需要通過先得到DNA的反向互補序列：Sequence->Nuleic Acid->Reverse Complement,，再進行比對。
利用BioEdit的alignment功能找重疊區(qū)域:Accessory application->ClustalW multiple alignment,，使用默認設置,，比對結果顯示，中間重疊部分的序列大部分相似,。
如果重疊區(qū)不是大部分相同堿基,，請試著把一條序列反向互補，再比對,。

4.堿基的校準

在上一步的比對結果窗口,，先利用BioEdit得到兩條件序列合并后的一致序列：

Alignment菜單->Create Consensus Sequence。
如是中間重疊區(qū)有少部分堿基不一致,，可根據對應的峰圖文件ab1的質量信息,，修改堿基。

修改堿基前,，需要先把bioedit的Mode設置為”Edit”與”Insert”,，并選中按鈕”view conservation plotting identities […] with a dot”，以點顯示相同的堿基,，便于觀察差異位點,。

在BioEdit中打開正向和反向測序結果的AB1文件和上面比對結果放同一窗戶(如圖)。
定位到差異堿基的位置（下圖黑色部分）,，一般可以在峰圖文件中查找不一致堿基（正反鏈錯配,、缺失或誤增堿基）及附近的幾個序列（點擊Edit菜單->find，或直接Ctrl-F）,，如查找GCAtAC,。
注意反向測序峰圖的搜索，需要輸入序列的反向互補序列（GTtTGC）,小寫字母為不一致堿基,。
查看該堿基及附近堿基正反測序峰圖形狀,，判斷該堿基正確的堿基序列。
然后在序列窗口中分別改正正向16SF,、反向16SR及Consensus序列中不一致的堿基,。如有空格(gap)顯示為”-“，需要把三條序列同一位置上的堿基與”-“都刪除,，才能保持后面的堿基比對結果正常(Backspace可刪除光標前一個堿基),。

在BioEdit中打開正向和反向測序結果的AB1文件和上面比對結果放同一窗戶(如