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腫瘤異質(zhì)性是腫瘤抗原逃逸,，產(chǎn)生耐受的重要原因，因而需要理解腫瘤異質(zhì)性的復(fù)雜性,，有針對性選擇新的靶點,，并進行新的CAR設(shè)計解決腫瘤異質(zhì)性，提高CAR-T療效,，克服逃逸引起的耐藥,。 01 — 腦部腫瘤異質(zhì)性與逃逸 腫瘤異質(zhì)性是腫瘤抗原逃逸，產(chǎn)生耐受的重要原因,，因而需要理解腫瘤異質(zhì)性的復(fù)雜性,，有針對性的進行CAR的設(shè)計。腫瘤細胞可塑性已被認定是腫瘤診斷和治療復(fù)雜化的主要因素,，細胞異質(zhì)性表現(xiàn)作為腦腫瘤最顯著的特征之一,，也是腦膠質(zhì)細胞瘤（GBM）耐藥的重要因素。 在過去的二十年里，GBM基因特征研究有了很大的發(fā)展,，基于關(guān)鍵致癌途徑突變和基因表達譜差異的亞型被鑒定,。GBM亞型的存在有助于解釋對治療的不同反應(yīng)，一些遺傳標記(如IDH 1/2,、MGMT,、H3K27)已被用來指導(dǎo)診斷和治療。亞型之間的切換也被證明與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān),。 然而,，腦腫瘤異質(zhì)性的復(fù)雜性似乎超出了某些基因和分子亞型的差異表達。 將GBMs分類為亞型,，主要集中在腫瘤整體水平上的遺傳特征,，從而簡化了GBMs實質(zhì)上的瘤內(nèi)異質(zhì)性。獨立的研究已經(jīng)闡明了腫瘤內(nèi)不同解剖區(qū)域的差異基因表達模式,，更確切地說,，GBMs的邊緣表現(xiàn)為代表性的神經(jīng)樣信號，而腫瘤的核心則表現(xiàn)為間充質(zhì)樣,。 單細胞水平的基因組分析進一步闡明了GBMs的腫瘤異質(zhì)性,。meyer和他的同事分析了從患者來源的gbm細胞中產(chǎn)生腫瘤的單個克隆，確定了具有抵抗諸如TMZ等抗腫瘤治療預(yù)先存在的克隆,。 結(jié)果表明,，治療前腫瘤異質(zhì)性可能與腫瘤復(fù)發(fā)的克隆選擇有關(guān)。除了從GBM腫瘤中分離和鑒定亞克隆外,，其他研究還使用先進的單細胞RNA測序(ScRNAseq)技術(shù)直接對原發(fā)腫瘤細胞進行測序,。 所有患者使用IDH 1/2或H3K27等成熟標記物分類為不同的腦腫瘤亞群，但仍發(fā)現(xiàn)明顯的瘤內(nèi)細胞與細胞間異質(zhì)性,。 在多種轉(zhuǎn)錄芯片實驗中觀察到不同的變化,，這些轉(zhuǎn)錄程序調(diào)控致癌信號、增殖,、補體/免疫反應(yīng)和缺氧,。此外，還將scRNAseq數(shù)據(jù)與癌癥基因組圖譜(TCGA)建立的原始分類方案進行了比較,，以區(qū)分四種GBM亞型：原神經(jīng)元型,、神經(jīng)元性，經(jīng)典型和間充質(zhì)型,。重要的是，TCGA亞型是從大體積腫瘤剖面中建立的,，而scRNAseq亞型在類似于塊狀腫瘤的比較中表現(xiàn)為四種亞型,。然而，通過單細胞RNAseq分析，所有五個被評價的腫瘤都有單獨的原神經(jīng)元亞型細胞,，而不管腫瘤的主要亞型是什么,。這種分子和細胞動態(tài)分類比群體級別的分類，能更好地解釋疾病的復(fù)雜性,。 有趣的是,，scRNAseq還揭示了腦腫瘤異質(zhì)性的非自主調(diào)節(jié)機制。IDH突變型星形細胞瘤與少突膠質(zhì)細胞瘤的單細胞轉(zhuǎn)錄本比較,，膠質(zhì)細胞譜系組成無顯著性差異,，提示存在常見的惡性再分化；此外,，更高級別的星形細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤被發(fā)現(xiàn)與巨噬細胞在小膠質(zhì)細胞上的富集有關(guān),。在GBMs中，免疫信號在不同亞型中不同,，間質(zhì)樣腫瘤存在免疫相關(guān)基因的富集,。此外，與原發(fā)性GBMs相比,，復(fù)發(fā)的GBMs表現(xiàn)出浸潤免疫細胞的改變,，特別是單核細胞的減少。這些發(fā)現(xiàn)說明腦腫瘤在多個層面上的異質(zhì)性,，包括患者間,、腫瘤內(nèi)和腫瘤微環(huán)境內(nèi)。 即使CD 19-CAR T細胞治療B細胞惡性腫瘤成功,，用CD 19抗原治療后,，完全應(yīng)答的患者往往會復(fù)發(fā)。此外,，在GBM的CAR T細胞臨床研究中也觀察到靶抗原表達中的丟失,。比如IL13Rα2-CAR T治療后復(fù)發(fā)/復(fù)發(fā)腫瘤IL13Rα2丟失/減少。同樣,，在一項使用EGFRvIII-CAR T細胞的研究中,，有4/6的切除腫瘤的CAR后T細胞出現(xiàn)明顯的EGFRvIII下調(diào)，推進針對腦腫瘤的CAR治療需要采取策略,，以盡量減少腫瘤異質(zhì)性所引起的抗原逃逸,。 02 — 開發(fā)新靶點 腦腫瘤中腫瘤抗原的異質(zhì)性導(dǎo)致了對CAR T細胞的抗藥性，表明需要擴大靶向抗原選擇范圍,。CD 19-CAR T細胞的成功突出了理想的CAR靶點應(yīng)廣泛表達于不同腫瘤和瘤內(nèi)細胞亞群,。然而，在腦腫瘤中發(fā)現(xiàn)這類抗原一直是一個挑戰(zhàn),，因為腦腫瘤細胞表達了許多由正常腦區(qū)(如CD 133,、CD 44,、Nestin、GFAP)所共有的標記物,，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的非腫瘤靶向效應(yīng)遠不如人體其他部位所能忍受,。因此，腦腫瘤中CAR T細胞靶點的發(fā)現(xiàn)需要考慮腫瘤抗原表達的廣泛性和特異性,。 包括IL13Rα2,，EGFRvIII和HER 2，在內(nèi)被用于腦腫瘤的CAR治療靶點如下表 促紅細胞生成素的肝細胞受體A2(EphA2)在GBMs中被發(fā)現(xiàn)過度表達,，并能促進腫瘤的發(fā)生和遷移,。EphA 2抑制劑在胰管腺癌小鼠模型中顯示出抗腫瘤作用。E phA 2-靶向C AR T在臨床前的研究中能夠消除GBMs,，但持續(xù)時間有限,。目前在GBM患者中正在評估 EphA2-CAR T細胞，但還沒有臨床結(jié)果報道(NCT 02575261),。 另一種作為CAR靶標而被廣泛研究的抗原是GD2,。GD2在一種名為彌漫性中線膠質(zhì)瘤(DMGS)的兒童腦腫瘤中表達，這種腫瘤含有組蛋白H3K27的突變,。GD2-CART細胞在DMGS的臨床前模型中,，即使腫瘤擴散到脊髓，也能有效地控制腫瘤的生長,。GD2-CAR T細胞耐受性好,，在神經(jīng)母細胞瘤患者中表現(xiàn)出一定的臨床活性，但其臨床抗腫瘤療效和抗DMGS的安全性有待探討,。 B7-H3(CD276)是一種免疫檢查點分子,，負調(diào)控T細胞活化，還與腫瘤的遷移和侵襲有關(guān),。對TCGA數(shù)據(jù)庫的分析表明B7-H3的表達上調(diào),，特別是在惡性的膠質(zhì)瘤中。Majzner和他的同事開發(fā)了一種針對多種類型兒童腫瘤(包括髓母細胞瘤)的CAR靶向B7-H3,，表明B7-H3-CAR t細胞可能在臨床上應(yīng)用于某些類型的腦腫瘤,。 另一項研究篩選了一組代表不同分子亞型的初級gbm樣本，并鑒定出硫酸軟骨素硫酸蛋白多糖4(CSPG 4,，也稱為神經(jīng)元膠質(zhì)抗原2,，NG2)在這些腫瘤中廣泛表達。此外,，CSPG4的表達可由免疫刺激的細胞因子TNFα誘導(dǎo),，而CSPG 4是在CART細胞抗腫瘤反應(yīng)中產(chǎn)生的，從而使腫瘤抗原逃逸的可能性較小,。 膠質(zhì)母細胞瘤包含具有自我更新和腫瘤再生特性的特定亞群,，研究顯示了這些GBM干細胞（GSCS）介導(dǎo)抵抗放療和化療的耐受性,。消除GSCS的能力對于GBM靶向治療是至關(guān)重要，以最小化腫瘤復(fù)發(fā),。一方面，使用該策略從切除的GBMS中富集和擴增腫瘤球,，個不同的研究證明了靶向IL13Ra2,、HER2和EGFRVIII的CART細胞能夠消除分化的GBM細胞以及GSCs，表明CAR介導(dǎo)的細胞毒性不依賴于GBM細胞,。另一方面,，已經(jīng)針對CD133開發(fā)了CART細胞，CD133是包括GSCs的癌癥干細胞的表面標記之一,。T細胞在臨床前表現(xiàn)出對患者來源的GSCS的細胞毒性,，以及對肝、胰和結(jié)腸腫瘤患者的抗腫瘤反應(yīng),。然而,，CD 133也在神經(jīng)干細胞中表達，從而增加了應(yīng)用CD 133-CARs治療GBM患者的安全性,。 此外,，預(yù)期適用于T細胞靶向的腦腫瘤抗原池預(yù)期會擴大到膜相關(guān)蛋白之外。Chheda和同事發(fā)現(xiàn)了來自H3.3K27.刺激HLA-A2的DIPG患者的共享新抗原,，突變肽的CD8T細胞產(chǎn)生TCR克隆,，當在T細胞上表達時，該TCR克隆介導(dǎo)對含有相同突變的腫瘤細胞的細胞毒性,。此外,，最近的一些研究已經(jīng)開發(fā)了抗可溶性蛋白的CAR 表明了靶向腦腫瘤特異性分泌因子的潛力。 這些努力擴大了GBM和其他腦腫瘤靶點的識別范圍,，為CART細胞治療的發(fā)展提供了新的選擇,。當然，關(guān)鍵的基準將是在精心設(shè)計的臨床試驗中確定這些新抗原的安全性,。一旦安全建立,，就有巨大的機會利用針對這些抗原中一種或幾種抗原的CART細胞來對付廣泛的腦腫瘤以及更廣泛的瘤內(nèi)細胞亞群。同時,，CART治療GSCs的能力可進一步降低腫瘤復(fù)發(fā),。 03 — 提高CAR設(shè)計解決抗原逃逸問題 盡管出現(xiàn)了針對腦腫瘤的直接CART細胞療法的新靶點，復(fù)發(fā)性腫瘤可能仍然能夠通過下調(diào)靶向抗原或出現(xiàn)抗原陰性克隆而繞過單價CART細胞,。因此,，一項針對抗原逃逸的策略是延長常規(guī)的單靶向CAR設(shè)計，以涵蓋雙特異性靶向結(jié)構(gòu)域,，從而識別兩種足以觸發(fā)T細胞活化的抗原之一,。這些“或門控”的設(shè)計可能會增加非腫瘤靶向潛力的安全性問題,。雙特異性CARS的靶標一般是從腫瘤特異性抗原庫中篩選出來的，或者是在確定了一價CAR靶向安全性之后,。其中一個例子是CD22,，另一種用于正常和惡性b細胞的細胞表面標記物CD19.和CD 22單靶點的CART細胞在b-ALL患者中耐受性較好，CD 19/CD 22雙特異性Car t細胞目前正在多個臨床試驗中進行研究(nct 03448393,，nct 03233854,，nct 03241940)。此外,，另一種b細胞表面標記CD 20與CD 19聯(lián)合產(chǎn)生了一種雙特異性car,，在臨床前的模型中可以根除表達這兩種抗原的淋巴瘤。 同樣,，針對 GBMS 的雙特異性 CARS 的設(shè)計也集中在臨床前和臨床研究中的抗原上,，包括 IL 13 Rα2 、 HER2 和 EphA 2 ,。Hedge和他的同事用表達兩種抗原的原位 GBM 異種移植模型開發(fā)了一種雙特異性靶向 IL 13 Rα2 和 HER 2. 的 CAR ,，作者表明雙特異性 CAR 能夠控制腫瘤約 1 個月，而單靶向 CAR 治療不會導(dǎo)致腫瘤因抗原逃逸而導(dǎo)致腫瘤消退,。這種方法進一步擴展到針對 EphA2. 的第三個靶向域,，然而，在這些 CAR 的所有臨床前研究中都發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā),，所有靶向抗原都丟失了,，這些研究提出了最小抗原逃逸的問題。 雙或三特定CAR的最佳結(jié)構(gòu)設(shè)計仍在抗原的抗體結(jié)合,，或者配體結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)域,。目前,已經(jīng)有兩種不同的結(jié)構(gòu)設(shè)計,針對“OR‐gate”目標戰(zhàn)略進行了測試。“串聯(lián)”設(shè)計提出了每個單鏈可變片段(scFv)的重鏈和輕鏈順序連接,，而“回路”設(shè)計類似于結(jié)構(gòu)二價抗體,。不同“ORgate”的比較設(shè)計是在 CD 19 / CD 22 雙特異性的背景下進行，顯示“回路”優(yōu)于“串聯(lián)”在介導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng),。沒有類似的研究靶向其它抗原,，但結(jié)果來自CD19/CD22的CAR設(shè)計表明，CAR分子(二價設(shè)計,、接頭長度和scFv序列)對CAR產(chǎn)品的效力至關(guān)重要,。 優(yōu)化的CAR設(shè)計的選擇需要廣泛的功能評估，通過工程T細胞識別單個或雙重目標和/或計算模擬熱力學(xué)CAR抗原相互作用,。
腫瘤特異性抗原與新型 CAR 設(shè)計的發(fā)展對抗腦腫瘤有了重大進展,。盡管已經(jīng)顯示了組合目標,在解決腫瘤異質(zhì)性方面的前景，在優(yōu)化目標抗原的數(shù)量和組合方面,，目前仍在觀察,。大部分不確定性來自于缺乏對細胞免疫后腫瘤動態(tài)變化的再識別攻擊，因此,，揭示CAR治療后腦腫瘤的演化,，尤其是腫瘤內(nèi)細胞亞群的單細胞圖譜改變，將為指導(dǎo)CAR T細胞治療和克服腫瘤異質(zhì)性提供有價值的信息,。 主要參考文獻 David Akhavan,，Immunological Reviews. 2019;290:60–84. Kawalekar OU. Immunity.2016;44(2):380‐390. |
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