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炎癥（inflammation）是機(jī)體對(duì)病原微生物感染和組織損傷一種快速而協(xié)調(diào)的反應(yīng),。這些刺激導(dǎo)致免疫細(xì)胞向感染和損傷部位遷移。對(duì)于許多人來(lái)說(shuō),，炎癥被認(rèn)為是一種不良的機(jī)體反應(yīng),，因?yàn)樗梢詫?dǎo)致嚴(yán)重的后果，如免疫功能障礙,，組織損傷,，敗血癥，器官衰竭,，甚至死亡,。然而，炎癥是一個(gè)關(guān)鍵的先天免疫過(guò)程,，它試圖控制感染,，激活適應(yīng)性免疫，修復(fù)受損組織,，并恢復(fù)到保持機(jī)體的穩(wěn)態(tài),。 炎癥小體（inflammasome）是炎癥反應(yīng)中重要的組成部分,，由多個(gè)蛋白組合而成的復(fù)合物,以caspase-1依耐性方式激活促炎細(xì)胞因子,包括interleukin-1β(IL-1β),以及誘導(dǎo)炎性細(xì)胞死亡。NLRP3炎性小體的不同尋常之處在于,，它可以由許多不同的刺激觸發(fā),，比如nigericin(一種鏈霉菌的抗生素)或受損細(xì)胞釋放的ATP。不受控制的NLRP3刺激可導(dǎo)致感染,、自身免疫性疾病,、神經(jīng)退行性疾病、代謝紊亂和許多其他人類(lèi)疾病,?？紤]到這些刺激的化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的多樣性，以及目前缺乏NLRP3直接與任何這些分子相互作用的證據(jù),，NLRP3被激活的機(jī)制仍然是一個(gè)未知之謎,。2018年底，美國(guó)德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的陳志堅(jiān)課題組在Nature上在線(xiàn)發(fā)表了題為“PtdIns4P on dispersed trans-Golgi network mediates NLRP3 inflammasome activation”的重量級(jí)文章,，剝開(kāi)了 NLRP3炎癥小體是如何識(shí)別大量多樣性的激動(dòng)劑,，從而使機(jī)體對(duì)外界病原體入侵和組織創(chuàng)傷等做出反應(yīng)的。該文發(fā)現(xiàn)了一種不同NLRP3刺激下游共同的細(xì)胞信號(hào)機(jī)制:高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（TGN,，trans-Golgi network）分解成各種分散的結(jié)構(gòu),，即形成分散的高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（dTNG,dispersed TGN）。然后NLRP3上的一個(gè)多堿性區(qū)域與dTGN上帶負(fù)電荷的PtdIns4P相互作用,，將NLRP3招募到dTGN上,。dTGN上的NLRP3形成多個(gè)點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)適配體蛋白（ASC）聚合,，從而激活下游信號(hào)級(jí)聯(lián),，下面我們就來(lái)一起深入了解下這篇文章精彩之處。 工欲善其事必先利其器,，一個(gè)巧妙的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能夠簡(jiǎn)單明了的證明復(fù)雜的分子行為過(guò)程,。本文中研究者建立了一種專(zhuān)門(mén)檢測(cè)NLRP3的活化生化檢測(cè)方法，一種上游穩(wěn)定表達(dá)NLRP3 (293 NLRP3)或下游特異表達(dá)ASC和caspase-1 (293 ASC-casp1)的HEK-293T細(xì)胞株,。將受刺激處理后的293 NLRP3 (activator )細(xì)胞中提取的提取物與下游293 ASC-caspase-1 ( receptor )細(xì)胞混合,，共同孵育后，檢測(cè)NLRP3依耐性的caspase-1的裂解,。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),，我們確定了NLRP3活性所在的亞細(xì)胞部分。HEK-293T細(xì)胞的提取物采用差速離心法分離將NLRP3-GFP細(xì)分為P5(重膜),， P100(輕膜)和S100(胞質(zhì))三種組分,，用NLRP3活性測(cè)定法測(cè)定其含量。雖然NLRP3蛋白主要存在于S100(胞質(zhì))中，然而NLRP3活性?xún)H在P100(輕膜)和P5(重膜)中被檢測(cè)到(圖1),，表明只有一小部分NLRP3在受到刺激后變得活躍,。這說(shuō)明原本主要存在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)的NLRP3在激動(dòng)劑（nigericin，Nig）處理后被招募到囊泡狀結(jié)構(gòu)上形成聚合物,。 圖1. NLRP 3刺激后形成多點(diǎn)分布 免疫熒光結(jié)果表明,，在正常條件下，NLRP3-GFP在胞質(zhì)中散在分布,，但經(jīng)刺激物處理后形成多個(gè)小斑點(diǎn),，這些斑點(diǎn)與ASC存在時(shí)形成的單個(gè)大斑點(diǎn)不同，這表明NLRP3首先聚集成多個(gè)小斑點(diǎn),，然后與ASC合并成一個(gè)大斑點(diǎn),。NLRP3的富集表明，這些斑點(diǎn)在粗細(xì)胞提取物中比NLRP3具有更高的比活性,，表明這些斑點(diǎn)是NLRP3的活性形式,，并且NLRP3小點(diǎn)形成于囊泡狀結(jié)構(gòu)亞細(xì)胞器的外部。為了了解這些小泡的起源,，研究者檢測(cè)了穩(wěn)定表達(dá)NLRP3-GFP的HeLa細(xì)胞中的各種亞細(xì)胞細(xì)胞器,。在刺激的條件下，TGN的反式面從單個(gè)核周簇分裂成小泡,，NLRP3在小泡上形成斑點(diǎn),。 圖2.NLRP3在dTGN上聚集 dTGN的形成早于NLRP3斑點(diǎn)形成，表明dTGN的存在可能是NLRP3招募,、聚集和激活的先決條件。這與研究者觀(guān)察到的NLRP3疾病突變體能夠繞過(guò)TGN招募是一致的,，因?yàn)樗鼈兡軌蛟诓皇艽碳さ那闆r下聚集在一起,。為了研究NLRP3是如何被招募到dTGN的，研究者檢測(cè)了幾個(gè)NLRP3的N端截短突變體,，發(fā)現(xiàn)連續(xù)缺失了四個(gè)賴(lài)氨酸殘基（KKKK motif）會(huì)突然終止NLRP3聚合,。這個(gè)基序是一個(gè)位于pyrin結(jié)構(gòu)域和NACHT結(jié)構(gòu)域之間的高度保守區(qū)域，在所有已知的NLRP3中至少含有三個(gè)帶正電荷的殘基,，這些結(jié)果表明,，包括KKKK基序在內(nèi)的保守的多堿性區(qū)域在刺激后將NLRP3招募到dTGN中起著關(guān)鍵作用，這對(duì)于隨后的激活至關(guān)重要,。 圖3.NLRP3通過(guò)其堿性區(qū)域被招募到dTGN中 根據(jù)前人的報(bào)道,，幾種已知的Rab GTPases通過(guò)多堿性區(qū)與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂PtdIns(3,4,5)P3和PtdIns(4,5)P2結(jié)合，為了檢測(cè)NLRP3中的多堿性區(qū)域是否通過(guò)類(lèi)似的機(jī)制介導(dǎo)其募集,，研究者純化了NLRP3多堿性區(qū)域的片段,，并通過(guò)脂質(zhì)印跡法檢測(cè)其與磷脂的結(jié)合，該片段與幾個(gè)帶負(fù)電荷的磷脂結(jié)合，NLRP3多堿性區(qū)域突變體并不能發(fā)生結(jié)合,。接下來(lái),，為了研究了在活細(xì)胞中，哪種磷脂對(duì)全長(zhǎng)NLRP3向dTGN的募集起重要作用,。研究者利用了磷脂酶的誘導(dǎo)募集體系,，在該體系中加入雷帕霉素促進(jìn)FKBP12和FRB的異二聚，從而將磷酸酶募集到TGN中,，使其水解目標(biāo)磷脂,。從而確定NLRP3通過(guò)與PtdIns4P結(jié)合而被招募到dTGN上的。 圖4.NLRP3通過(guò)與PtdIns4P結(jié)合而被招募到dTGN  本文綜合利用生化,、成像和遺傳學(xué)方法等方法,，巧妙的運(yùn)用細(xì)胞株重組系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)揭示了NLRP3激活的分子機(jī)制，進(jìn)一步在原代性巨噬細(xì)胞中驗(yàn)證,，揭示了不同來(lái)源,、以及化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特質(zhì)上千差萬(wàn)別的NLRP3激動(dòng)劑，觸發(fā)的一個(gè)共同的細(xì)胞信號(hào):TGN分解為dTGN,，其中NLRP3通過(guò)其多堿性區(qū)域與dTGN上的PtdIns4P之間的離子鍵被募集到dTGN上,。打破我們對(duì)于高爾基體功能傳統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，即蛋白質(zhì)進(jìn)行加工,、包裝,，運(yùn)輸?shù)墓δ堋＝沂玖烁郀柣w在炎癥信號(hào)通路中也發(fā)揮重要的功能,，然而對(duì)于組織創(chuàng)傷和病原微生物感染中如何控制過(guò)度的炎癥反應(yīng),，以及對(duì)于自身免疫疾病、阿爾茨海默病,、癌癥等多種疾病的治療和預(yù)防依然還任重道遠(yuǎn),。 參考資料； 1.Chen, J. and Z.J.Chen, PtdIns4P on dispersed trans-Golginetwork mediates NLRP3 inflammasome activation. Nature, 2018. 564(7734): p. 71-76. |
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