1問題背景 人胰島素是一種由兩條多肽鏈(A鏈和B鏈)組成的蛋白質(zhì)。胰島素合成時(shí),，最初在胰島B細(xì)胞內(nèi)的附著核糖體上形成的是一條單鏈多肽———前胰島素原,，其進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后，信號(hào)肽酶切除信號(hào)肽形成胰島素原,，后者被運(yùn)輸至高爾基體,，在高爾基體中切除連接序列(C鏈)形成A鏈和B鏈，然后通過二硫鍵將兩者結(jié)合形成有生物活性的胰島素,。 綜上可知,，在真核細(xì)胞中合成胰島素需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體參與加工，才能獲得有生物活性的胰島素,，最后通過高爾基體形成小泡將其分泌到細(xì)胞外,。而原核細(xì)胞中沒有對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工修飾的細(xì)胞器,，那么如何利用基因工程在大腸桿菌中合成有生物活性的胰島素呢?下面就此問題作簡(jiǎn)要分析。 2產(chǎn)人胰島素大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略 長(zhǎng)期以來已發(fā)展了多種大腸桿菌工程菌,，但是有代表性的構(gòu)建方案主要有下列三種,。 2.1 AB鏈分別表達(dá)法 該方法在早期重組大腸桿菌生產(chǎn)胰島素時(shí)采用。A鏈和B鏈的基因編碼區(qū)(不含內(nèi)含子)由化學(xué)合成并分別克隆在β－半乳糖苷酶基因的表達(dá)型質(zhì)粒上,，后者與胰島素編碼序列形成雜合基因,，其連接位點(diǎn)處為甲硫氨酸密碼子。重組分子分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細(xì)胞,，兩種克隆菌分別合成β－半乳糖苷酶－人胰島素A鏈融合蛋白以及β－半乳糖苷酶－人胰島素B鏈融合蛋白,。經(jīng)大規(guī)模發(fā)酵后，從菌體中分離純化融合蛋白,，再用溴化氰在甲硫氨酸殘基的C端以化學(xué)方法切斷融合蛋白,，釋放出人胰島素的A鏈和B鏈。由于β－半乳糖苷酶中含有多個(gè)甲硫氨酸殘基,，溴化氰處理后生成多個(gè)小分子多肽,，而A鏈和B鏈內(nèi)部均不含甲硫氨酸殘基，故不被溴化氰繼續(xù)降解,。A鏈和B鏈進(jìn)一步純化后,，以2∶1的分子比混合，并進(jìn)行體外化學(xué)折疊,。 2.2人胰島素原表達(dá)法 將人胰島素原cDNA編碼序列克隆在β－半乳糖苷酶基因的下游,，兩個(gè)DNA片段的連接處仍為甲硫氨酸密碼子。該雜合基因在大腸桿菌中高效表達(dá)后,，分離純化融合蛋白,，并同樣采用溴化氰特性化學(xué)裂解法回收人胰島素原片段，然后將之進(jìn)行體外折疊,。由于C鏈的存在,，胰島素原在復(fù)性條件下能形成天然的空間構(gòu)象，為三對(duì)二硫鍵的正確配對(duì)提供了良好的條件,，使得體外折疊率高達(dá)80%以上,。為了獲得具有生物活性的胰島素，經(jīng)折疊后的人胰島素原分子必須用胰蛋白酶特異性切除C鏈,。胰蛋白酶的作用位點(diǎn)位于精氨酸或賴氨酸殘基的羧基端,，由于天然構(gòu)象的存在，人胰島素原鏈第22位上的精氨酸殘基和第29位上的賴氨酸殘基對(duì)胰蛋白酶的作用均不敏感,。因此用胰蛋白酶處理人胰島素原后,，可獲得完整的A鏈以及C末端帶有精氨酸殘基的B鏈。也就是說，與人的天然胰島素相比,，這個(gè)B鏈多出一個(gè)氨基酸殘基,，后者再用高濃度的羧肽酶B專一性切除。 2.3 AB鏈同時(shí)表達(dá)法 該方法的基本思路是將人胰島素的A鏈和B鏈的基因編碼序列拼接在一起,，然后組裝在大腸桿菌β－半乳糖苷酶基因的下游,。重組子表達(dá)出的融合蛋白經(jīng)溴化氰處理后，分離純化A－B鏈多肽,，然后再根據(jù)兩條鏈連接處的氨基酸殘基性質(zhì),，采用相應(yīng)的裂解方法獲得A鏈和B鏈肽段，最終通過體外化學(xué)折疊制備具有活性的重組人胰島素,。與AB鏈分別表達(dá)法相似,，其最大的缺陷仍是體外折疊的正確率較低。 ——胡文斌.如何利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素.生物學(xué)教學(xué).2013年第3期（節(jié)選） |
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