熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization, FISH）通過熒光標記的核酸探針（~20nt-500nt）在組織細胞內(nèi)原位標記相應的RNA分子。一種熒光基團標記的一個探針對應一個基因RNA分子的一段序列,。超分辨率顯微鏡技術(shù)的發(fā)展,，使我們能看見細胞內(nèi)單個RNA分子。單分子熒光原位雜交（single molecule FISH,，smFISH）能分析單個基因的RNA分子拷貝數(shù)和原位分布情況,。受熒光基團和圖像采集通道的限制，smFISH只能同時看到4到5個基因的RNA分子分布情況,?？茖W家希望能同時分析多個基因乃至整個轉(zhuǎn)錄組水平RNA分子的時空分布情況，其中關(guān)鍵是結(jié)合超分辨率顯微鏡技術(shù)開發(fā)多路組合標記和多重讀取系統(tǒng)（multiplexing）以實現(xiàn)同時對多個基因的識別,。

2019年3月26日,，Nature在線發(fā)表了加州理工蔡龍（謝曉亮教授在哈佛培養(yǎng)的博士）實驗室的最新研究成果：Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH+。本文中,，通過seqFISH技術(shù)進行四輪的RNA分子條形碼標記（barcoding）實驗,，每輪實驗中通過其獨特60個假單色（pseudocolor）通道進行20次反復雜交和超分辨成像讀取。這樣,，在普通共聚焦顯微鏡上實現(xiàn)了對10,000基因的mRNA分子在組織原位的觀測和分析,。

seqFISH技術(shù)通過多輪的熒光原位雜交實驗和成像對單個RNA分子進行了條形碼式標記和識別（圖1）【1】。本文中每個基因設(shè)計有24個探針以識別,，每個探針分子上有四段（I-IV）延展序列,，以對應四輪的seqFISH標記實驗。每個延展序列能通過與對應的讀出探針（readout）雜交成像被讀取。每輪對RNA分子進行條形碼標記后,，加入當輪的讀出探針進行20次的反復雜交和成像讀取（圖1）,。在三個熒光通道成像的情況下實現(xiàn)了在組織原位的對10,000基因的RNA分子的檢測。

圖1 seqFISH+技術(shù)：seqFISH的條形碼標記和多重雜交成像讀取,。

本文中，對成像的細胞和神經(jīng)組織進行了透明化處理【2】,。本文能觀察到不同RNA分子有相應的亞細胞定位,，RNA分子呈現(xiàn)三個位置的聚集：核和近核區(qū)；胞質(zhì)區(qū)以及突出區(qū),，反映了它們在功能上的不同,。

圖2 RNA分子亞細胞定位富集

本文還對小鼠腦部皮層，室管膜下層和嗅球區(qū)域進行了轉(zhuǎn)錄組水平分析,，一共收集了2,963個細胞中RNA分子的分布,。其中在皮層區(qū)域，檢測讀取到平均約 5,615 ± 3,307 (mean ± s.d.) RNA分子,，分屬于 3,338 ± 1,489 (mean ± s.d.) 基因,。通過非監(jiān)督聚類分析，發(fā)現(xiàn)不同神經(jīng)細胞呈現(xiàn)分層排布,，和以前的單細胞RNAseq成果相符合（圖3）,。

圖3 不同皮層細胞呈現(xiàn)RNA分子組成的差異。

通過標記和讀取設(shè)計系統(tǒng)的開發(fā)創(chuàng)新,，本文在普通共聚焦顯微鏡下實現(xiàn)了對多基因（10,000）RNA分子在組織原位的定位和檢測分析,。單分子熒光超分辨率成像，組織透明化并膨大技術(shù),，RNA條形碼標記,，多重標記成像等多種技術(shù)并用，實現(xiàn)了對神經(jīng)組織進行單細胞轉(zhuǎn)錄組水平的分析,。

原文鏈接：

https://www./articles/s41586-019-1049-y

制版人：半夏

1. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M. & Cai, L. Single-cell in situRNA profiling by sequential hybridization. Nat. Methods 11, 360–361 (2014).

2. Yang, B. et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue throughwhole-body clearing. Cell 158, 945–958 (2014).