Cell重磅：多倫多大學(xué)華人學(xué)者Housheng Hansen He于2月7日在線發(fā)表關(guān)于局限性前列腺癌中環(huán)狀RNA的系統(tǒng)研究,。Housheng Hansen He是瑪格麗特公主癌癥中心高級科學(xué)家、多倫多大學(xué)醫(yī)學(xué)生物物理學(xué)系副教授,。

基礎(chǔ)——144例局限性前列腺癌標(biāo)本,，臨床資料詳細(xì)，隨訪時間中位數(shù)為6.5年,；
技術(shù)亮點(diǎn)：深度RNA-seq分析（囊括低豐度和非poly-A轉(zhuǎn)錄本）——融合基因,，線性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和circRNA（76311個circRNA分子，其中62個來源于融合基因）,，尋找與局限性前列腺癌密切相關(guān)的分子,；
接著，高通量shRNA文庫篩選（1507種circRNA及其所對應(yīng)的1075個host gene線性產(chǎn)物的shRNA）——分析與細(xì)胞增殖有關(guān)的circRNA分子,；
然后,，驗證候選分子在各種前列腺癌細(xì)胞系增殖能力的必要性，并發(fā)現(xiàn)這種必要性獨(dú)立于親本線性轉(zhuǎn)錄本而存在,；
最后,，circCSNK1G3的功能驗證——過表達(dá)和敲低，circCSNK1G3獨(dú)立于其線性對應(yīng)物驅(qū)動前列腺癌細(xì)胞增殖,；并探索其與miR181b/d的相互作用是否促進(jìn)細(xì)胞增殖,。

RNA環(huán)化是前列腺癌的一種普遍特征，數(shù)百種circRNA通過與其親本線性RNA不同的功能促進(jìn)細(xì)胞增殖

摘要
癌癥轉(zhuǎn)錄組非常復(fù)雜,，包括許多不是多腺苷酸化的低豐度轉(zhuǎn)錄本,。為了完全表征局限性前列腺癌的轉(zhuǎn)錄組，我們對144個具有豐富臨床注釋的腫瘤進(jìn)行了超深全RNA測序,。這揭示了與侵襲性導(dǎo)管內(nèi)癌亞組織學(xué)相關(guān)的線性轉(zhuǎn)錄組亞型以及區(qū)分局部與轉(zhuǎn)移性疾病的融合譜,。反剪接分析顯示廣泛的RNA環(huán)化，平均腫瘤表達(dá)7,232個環(huán)狀RNA（circRNA）,。在多個患者群組中,，circRNA產(chǎn)生的程度與疾病進(jìn)展相關(guān)。功能缺失篩選發(fā)現(xiàn)11.3% 的高豐度circRNA對細(xì)胞增殖至關(guān)重要; 其中90% ,，他們的親本線性轉(zhuǎn)錄本不是必需的,。單個circRNA可以具有不同的功能,，circCSNK1G3通過與miR-181相互作用促進(jìn)細(xì)胞生長。這些數(shù)據(jù)主張采用超深RNA-seq而無需多聚腺苷酸選擇來鑒定線性和環(huán)狀轉(zhuǎn)錄組,。

介紹
前列腺癌是全世界男性中最常被診斷出的非皮膚癌,。局部腫瘤通常可通過明確的局部治療來治愈,，但一旦腫瘤轉(zhuǎn)移到腺體外,，無法治愈可能是不可避免的。因此,，了解局部可治愈的前列腺腫瘤的生物學(xué)特征是臨床所必需的,。

直接結(jié)果，局部前列腺腫瘤的基因組已被充分研究,，使用微陣列和低覆蓋度聚腺苷酸化（poly-A）富集的RNA測序（RNA-seq）（癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡(luò)）對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了廣泛測定,。這些分析提示存在含有預(yù)后信息的多樣化轉(zhuǎn)錄組。

前列腺癌轉(zhuǎn)錄組中表征不佳的組分是環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物（circRNA）,，其與其他疾病有關(guān),。circRNA形成共價閉環(huán)，增加穩(wěn)定性并產(chǎn)生生物標(biāo)記潛力,，同時避免poly-A捕獲,。然而前列腺癌轉(zhuǎn)錄組的完全多樣性及其意義仍然不明。

為填補(bǔ)這一空白,，我們對144例局部前列腺腫瘤進(jìn)行了超深非poly-A RNA測序,，結(jié)合長期臨床隨訪。這使我們能夠以前所未有的深度繪制轉(zhuǎn)錄組圖譜,，確定1233個獨(dú)特的融合基因（21個復(fù)發(fā)和2個預(yù)后）和76,311個不同的circRNA,。circRNA的總載量與腫瘤侵襲性相關(guān)，并且鑒定了對前列腺癌細(xì)胞增殖必需的171種circRNA,。這些數(shù)據(jù)表明癌癥轉(zhuǎn)錄組具有許多功能實(shí)體,，這些功能實(shí)體無法用傳統(tǒng)的分子策略觀察到。

結(jié)果
1,、局部前列腺癌的轉(zhuǎn)錄組分析
為了評估前列腺癌的轉(zhuǎn)錄組,，我們招募了一組144名患有散發(fā)性、局限性,、中度風(fēng)險疾?。–PC-GENE，加拿大前列腺癌基因組網(wǎng)絡(luò)）的患者,。所有患者均接受根治性前列腺切除術(shù),，隨訪時間中位數(shù)為6.5年。對未經(jīng)治療的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢查，然后進(jìn)行宏觀解剖至腫瘤細(xì)胞性至少為70% ,。通過鏈特異性核糖體RNA缺失的RNA測序定量每個樣品的RNA,，每個腫瘤的定量中值為382百萬（M）±138M。

在通過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)處理管道處理后（表S1 ; 圖S1A）,，中位腫瘤含有118,753±7,373個轉(zhuǎn)錄物,，衍生自17,958±333個編碼和17,742±1,579個非編碼基因。在所有腫瘤中存在18,340個轉(zhuǎn)錄物,，包括15,112個蛋白質(zhì)編碼同種型,，例如AR，MYC和KLK3（圖1A和1B）,。高豐度轉(zhuǎn)錄本通常普遍存在：每個樣本中檢測到最多的——13416個中有12,797個,。相比之下，在5個或更少的樣本（即3.5% 的患者）中檢測到180個高豐度轉(zhuǎn)錄本的有趣子集,，使其成為候選增強(qiáng)子劫持事件。

癌癥基因組圖譜（TCGA）網(wǎng)絡(luò)鑒定了完整的前列腺癌亞型（Cancer Genome Atlas Research Network,，2015）,。為了將這些與轉(zhuǎn)錄組學(xué)亞型聯(lián)系起來，我們將無監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)應(yīng)用于所有樣本中檢測到的轉(zhuǎn)錄本的最高四分位數(shù),，按四分位數(shù)范圍排序,。這些4,585個轉(zhuǎn)錄本包括3,905個蛋白質(zhì)編碼和680個非編碼（353個反義，286個lncRNA [長非編碼RNA],，12個snRNA [小核RNA]和29個snoRNA [小核仁RNA]）并描繪了5個患者亞型（P1-P5） ）和五個RNA亞型（R1-R5; 圖1 C,，S1 B，和S1C）,。樣本聚類的平均輪廓得分為0.76,，基因聚類的平均得分為0.39（圖S1d）。P1-P3中的樣品具有更高的全局基因組不穩(wěn)定性,，評估為具有拷貝數(shù)畸變的基因組的百分比（PGA,，t檢驗，p = 3.29 x10-4 ; 圖S1E ）,。P1也比其他亞型有更高比例的前列腺癌驅(qū)動基因缺失,，包括腫瘤抑制因子NKX3-1（78% VS 42% ; p = 1.6 x10-3，比例檢驗）,，TP53（50% VS 19%; p = 8.0 x10-3,，比例檢驗）和PTEN（60% VS 30%; p = 8.7 x10-4，比例檢驗; 圖S1F ）,。有趣的是,，P1中63% 的樣本含有導(dǎo)管內(nèi)癌和篩狀結(jié)構(gòu)（IDC / CA），相對于其他亞型中20% 到40% 的患者（p = 0.013; 卡方檢驗）,。雖然IDC / CA與侵襲性前列腺癌相關(guān),，但生化復(fù)發(fā)率（BCR）在患者亞型中沒有差異（對數(shù)秩檢驗,，p = 0.88; 圖S1G ）。P2中的樣本具有最高比例的CHD1缺失（46% VS13% ; p = 3.4 x10-4 ;比例檢驗; 圖S1F）,，使人聯(lián)想到以SPOP和CHD1突變?yōu)樘卣鞯腡CGA亞型,。我們的轉(zhuǎn)錄組亞型與TCGA亞型的系統(tǒng)比較證實(shí)了P2與通過SPOP和CHD1突變區(qū)分的TCGA亞型的相似性。相比之下,，其他轉(zhuǎn)錄組亞型與特定TCGA亞型不匹配（圖S1H）,。

繼續(xù)將我們的轉(zhuǎn)錄組亞型與過去定義的拷貝數(shù)改變（CNA）進(jìn)行了比較（Fraser等，2017 ）：P3中44% （15/34）的樣本對應(yīng)于以復(fù)發(fā)性亞端粒擴(kuò)增為特征的基因組亞型,，而P4和P5對應(yīng)于拷貝數(shù)安靜的基因組亞型（72% ; 49/68; 圖S1I和S1J）,。盡管這些特異性成員重疊，但CNA和轉(zhuǎn)錄組亞型之間的總體相似性較低（調(diào)整后的Rand指數(shù)= 0.134）,，這表明多個轉(zhuǎn)錄組表型可以從單個基因組中出現(xiàn),。

為了評估每種RNA亞型的功能標(biāo)志，我們使用g：Profiler（Reimand等,，2016）來鑒定顯著富集的途徑（錯誤發(fā)現(xiàn)率[FDR] <0.05）,。由于R5富含免疫相關(guān)通路，我們將這些基因的豐度與免疫活性聯(lián)系起來,。R5中基因的平均豐度與浸潤免疫細(xì)胞的百分比以及細(xì)胞溶解活性呈正相關(guān)（Spearman's r = 0.66; p <2.2 x10-16,；Spearman's r = 0.67，p = 7.20 x10-19）,。這些通路的差異表明轉(zhuǎn)錄組亞型可以通過不同方式啟動或驅(qū)動,。

2、融合基因與侵略性局部疾病相關(guān)
為了鑒定候選腫瘤特異性亞型,，我們接下來評估融合基因的景觀,。我們的深度測序的高覆蓋率揭示了以往測序研究中未檢測到的融合，鑒定了1,223個獨(dú)特的融合（表S1）,。中位腫瘤具有14±13個不同的融合（中位數(shù)±SD）,。共有21次復(fù)發(fā)融合（≥10% 的隊列; 圖1D）。在復(fù)發(fā)性融合中,，13例是通讀融合,，包括幾乎所有患者（142/146）中觀察到的SLC45A3：ELK4融合，如預(yù)期（Rickman等,，2009）那樣,。先前未報道的通讀融合包括SCHLAP1 lncRNA和UBE2E3 mRNA。SCHLAP1與侵襲性前列腺癌相關(guān),，但這種融合與疾病復(fù)發(fā)無關(guān),。我們還鑒定了RP11-356O9.1和TTC6之間的通讀融合，這些基因與FOXA1側(cè)面相接，但位于相反的鏈上,。這種融合和TBCEL：TECTA都與BCR相關(guān)（圖S1M和S1N）,，并且兩者都有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險（p = 0.006;風(fēng)險比[HR] = 5.00,95% 置信區(qū)間[CI] = 1.6-15.7; 圖S1O）。

我們接下來檢查了21個復(fù)發(fā)融合的每個成對組合之間的關(guān)系,。復(fù)發(fā)融合的偶發(fā)性超過預(yù)期（置換測試10 6次迭代; p = 1.0 x10-6 ; 圖1D）,。有趣的是，腫瘤起始的TMPRSS2：ERG（T2E）融合既沒有顯著共存,，也沒有與其他共生相互排斥（超幾何測試; Q> 0.05）,。相反，SCHLAP1：UBE2E3融合與TBCEL：TECTA融合,，SAMD5：SASH1融合和AC004066.3：PPA2融合共同發(fā)生（超幾何測試; Q <0.05）,。與“Nimbosus”的概念一致，SCHLAP1：UBE2E3融合也與IDC / CA強(qiáng)烈相關(guān)（圖1D;比例檢驗; FDR = 0.0015）,。

為了理解體細(xì)胞突變和轉(zhuǎn)錄組之間的相互作用,，我們探索了復(fù)發(fā)融合與40個先前發(fā)表的基因組驅(qū)動事件之間的關(guān)聯(lián)（Cancer Genome Atlas Research Network，2015; Fraser等,，2017）,。重述先前的結(jié)果，T2E融合與TP53和PTEN突變相關(guān),，而T2E陰性腫瘤富集SPOP和CHD1突變（圖S1P）。SPOP突變與PRCAT47：CDYL2融合共同發(fā)生（比例檢驗; Q = 0.045）,。這些關(guān)聯(lián)證實(shí)了先前的發(fā)現(xiàn),，即SPOP突變通過獨(dú)立于T2E融合和PTEN缺失的機(jī)制驅(qū)動前列腺腫瘤發(fā)生（Blattner等，2017）,。

為了確定融合景觀是否隨著向致死性去勢抵抗疾病的轉(zhuǎn)變而變化,，我們使用相同的通道分析來自Stand Up 2 Cancer（SU2C）群組的轉(zhuǎn)移性病變的融合（圖1E）（Robinson等人，2015）,。盡管轉(zhuǎn)移灶的測序覆蓋率較低（中位數(shù)28 VS 14; p = 1.2 x10-8; Mann-Whitney U檢驗）,，但融合在轉(zhuǎn)移性和局部腫瘤中是常見的兩倍。共有33例復(fù)發(fā)融合,，包括在34% 的轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)了TBCEL：TECTA融合,。與局部疾病不同，轉(zhuǎn)移性病變的融合不會傾向于相互排斥或共同發(fā)生（排列檢驗,，106次迭代）,。總體而言,，相對于局部腫瘤,，轉(zhuǎn)移性腫瘤17個融合顯著富集，6個富集顯著減少，包括轉(zhuǎn)移性病變中的12個復(fù)發(fā),，但在局部腫瘤中未檢測到（邏輯回歸和Fisher精確檢驗; Q <0.05; 圖1E）,。融合基因的這種轉(zhuǎn)變可能表明選擇性適應(yīng)治療和適應(yīng)轉(zhuǎn)移部位或疾病進(jìn)展，并且它突出了新的候選轉(zhuǎn)移驅(qū)動因素,。

3,、局限性前列腺癌的circRNAs景觀
前列腺癌中無處不在的通讀融合表明功能失調(diào)的轉(zhuǎn)錄和剪接機(jī)制可能影響RNA環(huán)化等剪接事件。我們的數(shù)據(jù)為評估circRNA提供了獨(dú)特的機(jī)會,，使用CIRCexplorer（Zhang等,，2014），我們在CPC-GENE群組中鑒定了76,311個不同的circRNA（R2反向剪接[BSR]）（圖2A）,。BSR通常遵循負(fù)二項分布（圖S2A和S2B）,，允許通過FPKM（每百萬映射讀數(shù)的每千堿基轉(zhuǎn)錄物的片段）定量計算circRNA豐度。使用線性融合轉(zhuǎn)錄物信息,，我們檢測到62個融合circRNAs（f-circRNAs）,，其在腫瘤中更頻繁地發(fā)生（圖S2C）。由于f-circRNAs復(fù)發(fā)缺乏,，我們聚焦于經(jīng)典circRNAs,，但這些f-circRNAs代表了一類有趣的候選生物標(biāo)志物。
為了驗證已鑒定的circRNAs,，我們利用了circRNAs對外切核酸酶降解具有抗性并因此可以通過RNase R處理富集的事實(shí),。我們在四種前列腺癌細(xì)胞系中使用和不使用RNase R處理進(jìn)行RiboMinus RNA-seq：LNCaP，V16A,，22Rv1和PC-3,。該分析鑒定了34,286個circRNAs，其中33,806個在RNase R處理后富集至少1.5倍（圖2A）,。我們專注于高信度的25,036個circRNAs,，其在細(xì)胞系中富含RNase R并且在腫瘤中檢測到（具有至少兩個BSR）（圖2A ）。

為了進(jìn)一步驗證高可信度circRNAs,，我們分析了49個前列腺腫瘤的獨(dú)立隊列（NGS-ProToCol,，表S1）。在該驗證隊列中檢測到約87% 的高可信度circRNAs（圖S2D）,，并且它們的豐度高度相關(guān)（Spearman's r = 0.71,，p <2.2 x10-16; 圖S2E）。這些circRNAs映射到比偶然預(yù)期更早復(fù)制的基因組區(qū)域（p = 1 x10-6）,，表明circRNAs與復(fù)制時間之間存在聯(lián)系,。

為了鑒定前列腺特異性circRNAs，我們將circRNAs與circBase中的已知注釋進(jìn)行了比較（Glazar等,，2014）,。有趣的是,，在鑒定的11個細(xì)胞或組織源中只有1個檢測到所有circRNAs的67%（圖2B，2C,，S2F和S2G）,。為了確定患者在circRNAs豐度譜中的特異性程度，我們計算了每個樣本中檢測到的分子的所占分?jǐn)?shù),，分為三類：親本線性,，全線性和圓形。這里,，圓形和線形形式分別指基因水平的環(huán)狀和線性RNA轉(zhuǎn)錄物（STAR方法）,。實(shí)際上，對于圓形形式,，這個值要低得多,，這表明具有更高患者特異性圖譜（圖2D，S2H和S2J）,。親本線性形式的高值表明circRNAs傾向于由幾乎所有腫瘤中存在的基因產(chǎn)生,。實(shí)際上，親本基因富集了與中心體,，紡錘體和ATP酶活性相關(guān)的管家進(jìn)程（圖S2K ）,。

親代基因在特定途徑中的富集鼓勵我們量化環(huán)化基因的特征。circRNAs的親本基因具有更長并且更多的剪接事件（圖S2L -S2N）,。側(cè)翼circRNAs的內(nèi)含子顯著更長（Mann-Whitney U檢驗; p <2.2 x10-16 ; CLES [共同語言效應(yīng)大小; McGraw和Wong,，1992 ] = 0.76），GC含量較低（Mann-Whitney U檢驗; p < 2.2 x10-16 ; CLES = 0.42; 圖S2O和S2P）,，并且富集了先前報道的circRNAs生物發(fā)生調(diào)節(jié)劑（圖S2 Q-S2S）（Conn等,，2015; Kramer等，2015; Li等,，2017; Liang等，2017; Shi等,，2017; ENCODE項目聯(lián)盟,，2012年; Zhang等，2014）,。我們評估了每種基因的8個特征（STAR方法; 表S2;圖S2T）,，并量化了它們區(qū)分產(chǎn)生circRNAs的基因與從10,000次迭代計算的基因的能力;圖2 F和S2U）。預(yù)測的親本基因更長并且在更多樣品中檢測到（Mann-Whitney U檢驗,，p <2.2 x10-16,，圖S2V和S2W）。這些結(jié)果表明,，circRNAs產(chǎn)生所需的一些信息嵌入基因組中,。 而高豐度circRNAs傾向于具有高豐度的線性對應(yīng)物（圖2G和S2X）,，環(huán)狀和線性的轉(zhuǎn)錄物之間的相關(guān)性通常較低（圖2G，軸）,。實(shí)際上,，只有3.0% 的circRNAs與其線性對應(yīng)物的豐度在統(tǒng)計學(xué)上相關(guān)（FDR <0.05），表明circRNAs產(chǎn)生的動態(tài)調(diào)節(jié),。雖然觀察到替代和反向剪接程度之間的總體正相關(guān)（圖S2Y）,，但基因之間的相關(guān)性不同（圖S2Z）。在97% 的病例中,，線性形式的豐度高于circRNAs（Salzman等,，2012）。然而,，127個circRNAs顯示出比其線性對應(yīng)物顯著更高的豐度（FDR <0.05; 圖2H）,。

4、circRNAs豐度劃分臨床上不同的腫瘤亞型
為了評估circRNAs是否劃分了特定的亞型,，我們對所有144個腫瘤進(jìn)行了共聚分析,。與線性RNA相比，我們沒有觀察到不同的亞型,。相反,，circRNAs的最強(qiáng)模式對應(yīng)于它們在每個樣品中的總體豐度（圖S3A）。為了量化這一點(diǎn),，我們計算了circRNA指數(shù)（CRI,，STAR方法）并將患者分組為四分位數(shù)（圖3A ; Q1-Q4）。較高的CRI與更多的通讀和ETS融合事件顯著相關(guān)（Mann-Whitney U檢驗; p = 1.4 x10-2和2.3 x10-3; CLES = 0.62和0.65; 圖S3B; 表S3）,，支持融合和circRNAs產(chǎn)生共同機(jī)制的參與（Liang et al,，2017）。

具有非常高（Q4）或極低（Q1）CRI的腫瘤在治療后具有升高的BCR率（圖S3C）,。實(shí)際上,，具有極端circRNA分布（Q1，Q4）的患者的預(yù)后明顯差于具有穩(wěn)定分布的患者（Q2,，Q3; 圖3B和S3D）,。該關(guān)聯(lián)在獨(dú)立的NGS-ProToCol隊列中復(fù)制（圖3C）。極端CRI組也與匯集隊列中較高的轉(zhuǎn)移發(fā)生率相關(guān)（圖3D）,。對circRNA親本基因的類似分析顯示沒有這種關(guān)聯(lián)（圖S3E -S3G）,。為了進(jìn)一步表征circRNA的臨床相關(guān)性，我們評估了個體circRNAs與BCR之間的關(guān)聯(lián)（STAR方法）并對其線性對應(yīng)物進(jìn)行相同的分析,。circRNA的HRs范圍和變異（log 2 HR：2.97-6.03）大于線性形式（1.99-2.02）,。重要的是，圓形和線形之間HR 的低相關(guān)性（圖3E,，r = 0.07,，p = 1.50 x10-19）表明了不同的潛在生物學(xué)機(jī)制,。因此，總circRNAs豐度和特定circRNAs的豐度都與臨床結(jié)果相關(guān),，表明這些circRNAs 不僅僅是轉(zhuǎn)錄噪聲,，而且可能具有特定的致癌功能。

5,、功能篩選鑒定必需的circRNAs
為了評估特定circRNAs的功能重要性,，我們在前列腺癌細(xì)胞系中選擇了2,000種最豐富的參與基于shRNA的功能缺失篩選。為了特異性沉默circRNAs,，我們設(shè)計了靶向反向剪接位點(diǎn)的shRNA（圖4A）,。我們還設(shè)計了針對circRNAs外顯子之外的線性轉(zhuǎn)錄物的shRNA，以評估線性形式的功能（圖4A）,。得到的文庫靶向1,507個circRNAs和1,075個線性對應(yīng)物,，每個至少有兩個shRNA（圖4B; 表S4）。在四種前列腺癌細(xì)胞系中的文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)和嘌呤霉素選擇后,，收集第0天（T0）的采樣群體和第8天（T8）和第16天（T16）的兩個進(jìn)化群體（圖S4A ; STAR方法）,。 

為了確定篩選的功效，我們應(yīng)用MaGeCK來鑒定缺失的線性轉(zhuǎn)錄物（Li,，2014b）,。對于所有篩選，陽性對照顯示出顯著更高的脫落（Mann-Whitney U檢驗; p = 1.7 x10-28,，CLES = 0.86）,，而陰性對照則沒有（Mann-Whitney U檢驗; p = 0.92; 圖4 C和S4 B-S4D）。脫落水平與時間點(diǎn)之間高度相關(guān),，通過歸一化的shRNA豐度的倍數(shù)變化測得（圖4 d和S4 E-S4G）,。此外，我們的篩選中缺失的線性轉(zhuǎn)錄本在Achilles shRNA和CRISPR篩選中顯示出顯著更高的脫落（Mann-Whitney U檢驗; p = 5.2 x10-11和1.4 x10-4; CLES = 0.325和0.330,；圖S4H和S4I）,。受這些結(jié)果的鼓舞，我們采用了該方法來識別缺失的circRNAs,?？偣?71個circRNAs（篩選的11.3% ）在至少一種細(xì)胞系中是必需的（圖4E）。在91.8% 的circRNAs必需的病例中,，其線性對應(yīng)物不是必需的（圖4F），表明circRNAs驅(qū)動細(xì)胞增殖而不依賴于它們的線性對應(yīng)物,。

6,、circRNAs的必要性獨(dú)立于親本線性轉(zhuǎn)錄本
我們隨機(jī)選擇了至少兩個細(xì)胞系中必需的10個circRNA進(jìn)行驗證。設(shè)計跨越反剪接點(diǎn)的不同引物以檢測circRNAs,。Sanger測序證實(shí)了連接位點(diǎn),，RNase R處理后進(jìn)行qRT-PCR分析證實(shí)了它們的環(huán)化（圖S4J和S4K）,。所有10個circRNAs主要定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖S4L），與先前的報道一致,，即大多數(shù)circRNAs定位于細(xì)胞核外（Jeck,，2013; Salzman，2012）,。

然后我們在用兩個單獨(dú)的shRNA敲低（KD）這些circRNAs時進(jìn)行細(xì)胞增殖測定,。qRTPCR分析確認(rèn)每種shRNA的KD效率，其中大多數(shù)導(dǎo)致circRNAs豐度降低> 80% （圖S4M）,。與KD對照相比,，在40個KD樣品中觀察到38個顯著降低的增殖率，驗證了它們的必要性（圖4G）,。盡管20種shRNA中有6種對線性RNA豐度具有適度影響,，但蛋白質(zhì)豐度未受影響（圖S4M和S4N）。相比之下,，對于8個具有驗證抗體的基因,，在7個病例中降低了蛋白質(zhì)豐度（圖S4N）。我們因此推測在circRNAs的KD中觀察到的對細(xì)胞增殖的影響不是由線性形式的脫靶效應(yīng)引起的,。作為進(jìn)一步的確認(rèn),，我們研究了這些circRNAs的過表達(dá)（OE）和觀察到40個OE樣品中有28個細(xì)胞增殖率增加，佐證了KD結(jié)果（圖4 G和S4O）,。

在10個親本線性轉(zhuǎn)錄本中,，PHIP是我們shRNA篩選中唯一必需的。一致地,，PHIP在Achilles CRISPR篩選中具有最高的輟學(xué)水平（圖4H和S4P ）（Meyers等,，2017 ）。由于我們篩選靶向PHIP的兩個shRNA不影響其蛋白質(zhì)豐度（圖S4N ）,，我們設(shè)計了小干擾RNA（siRNA）以確定其對細(xì)胞增殖的影響,。作為對照，我們還使用經(jīng)過驗證的抗體為七種非必需基因設(shè)計了siRNA,。我們確認(rèn)了六種基因的RNA和蛋白質(zhì)水平的KD效率（圖S4Q和S4R）,。在4個和2個細(xì)胞系中觀察到PHIP和EZH2的增殖率降低（圖S4S）。與我們的shRNA和公共CRISPR篩選一致,，對于其他四種基因沒有觀察到增殖率的明顯變化（圖S4S）,。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了我們的篩選的精確性，并表明必需的circRNAs的大多數(shù)線性對應(yīng)物本身不是必需的,。

為了確定circRNAs同種型的功能是否存在冗余,，我們通過OE替代同種型進(jìn)行KD拯救實(shí)驗，其中共有10個circRNAs中的9個共有外顯子（圖S5A）,。觀察到5個circRNAs的部分拯救,，表明一些功能冗余（圖S5B）,。因為我們的屏幕專注于高度豐富的同種型（圖S5C），所以功能可能由篩選的同種型決定,。然而,，這些研究強(qiáng)調(diào)了circRNAs同種型之間功能性相互作用的可能性。

7,、必需circRNAs的功能表征
我們接下來試圖表征必要circRNAs的功能,。在10種circRNAs中，circCSNK1G3特別令人感興趣：其線性形式在四種前列腺癌細(xì)胞系或任何Achilles篩選中都不是必需的,。與此相反,，circCSNK1G3是在所有四個前列腺癌細(xì)胞系和表示其它腫瘤類型兩種細(xì)胞系是必需的（圖4G和S5D-S5F）。circCSNK1G3由三個外顯子組成,，總長度為536個堿基對（bp）,，并且以與其線性對應(yīng)物相似的豐度存在（圓形：線性比率：0.79; 圖5A 和5B）。

為了研究circCSNK1G3促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制,，我們在circCSNK1G3的KD或OE后在PC-3細(xì)胞中進(jìn)行RNA-seq,。基因集富集分析（GSEA）（Subramanian,，2005）表明,，許多基因在OE樣品中上調(diào)而在KD樣品下調(diào)，反之亦然（圖5 C和S5 G）,。對于另外兩種circRNAs,，circSTAU2和circGOLPH3也觀察到類似的模式（圖S5H 和S5I），表明在KD和OE實(shí)驗中觀察到的表型不是由脫靶效應(yīng)引起的,。我們通過來自O(shè)E和KD研究的circCSNK1G3鑒定了279個活化的和196個被抑制的基因（圖5C ; 表S5）,。我們還在CSNK1G3 KD后進(jìn)行RNA-seq分析，并且僅觀察到由環(huán)狀和線性亞型型共有的六個靶基因（圖5D）,。circCSNK1G3激活基因的最高富集的條目是與細(xì)胞周期相關(guān)（圖5E）,，與其促進(jìn)細(xì)胞增殖一致。相比之下,，CSNK1G3激活基因的最高濃度術(shù)語是“對酸化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)”（圖5F）,，與其報道的功能一致。這些數(shù)據(jù)表明circCSNK1G3獨(dú)立于其線性對應(yīng)物驅(qū)動前列腺癌細(xì)胞增殖,。

由于circRNAs通常通過與微小RNA（miRNA）相互作用起作用,，我們搜索了與circCSNK1G3相互作用的候選miRNA。通過計算機(jī)預(yù)測和銀酸交聯(lián)過濾和免疫沉淀測序（AGO-CLIP-seq）數(shù)據(jù)（STAR方法）,，我們確定了10個候選miRNA,。使用來自CPC-GENE隊列的子集（n = 119）的miRNA譜分析數(shù)據(jù)，我們分析了miRNA與circCSNK1G3之間的相關(guān)性。五種miRNA,，miR-181a / b / c / d和miR-196b，與circCSNK1G3表達(dá)顯著相關(guān)（圖6A ; 表S6）,。預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)位于外顯子2的高度保守的AGO結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)（圖6B）,。然后我們使用生物素化的circCSNK1G3進(jìn)行RNA pulldown測定，并且僅觀察到miR-181b / d的顯著富集（圖6C）,。相比之下,，miR-7在ciRS-7 pulldown中顯著富集，而miR-181和miR-196沒有（圖S6A）,。通過circCSNK1G3的生物素化miR-181b / d pulldown進(jìn)一步證實(shí)了這種相互作用（圖6D）,。敲低 circCSNK1G3降低了miR181b / d豐度，而過表達(dá)增加其豐度（圖S6B）,。ciRS-7報道了類似的觀察結(jié)果,，其中ciRS-7的敲除下調(diào)了其相互作用的miR-7（Piwecka，2017）,。PC-3細(xì)胞中的miR-181b / d 過表達(dá)顯著降低CBX7豐度,，CBX7是一種充分表征的miR-181b靶標(biāo)和前列腺癌中的腫瘤抑制因子（圖6E）（Mansueto，2010; O'Loghlen,，2012）,。與circCSNK1G3敲低后miR-181b / d的下調(diào)一致，CBX7豐度顯著增加（圖6F）,。類似地,，雖然細(xì)胞周期基因如CDK1和CDC25A在miR-181b / d 過表達(dá)細(xì)胞中上調(diào)，但它們在circCSNK1G3 KD細(xì)胞中下調(diào)（圖6E 和6F）,。與細(xì)胞周期基因的上調(diào)一致,，miR-181b / d的過表達(dá)增加PC-3細(xì)胞增殖（圖6G）。重要的是,，miR-181b / d的過表達(dá)顯著減弱了由circCSNK1G3的KD誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖阻斷（圖6G）,。總之,，這些數(shù)據(jù)表明circCSNK1G3至少部分通過與miR181b / d的相互作用促進(jìn)細(xì)胞增殖,。

討論
目前大多數(shù)人類腫瘤的轉(zhuǎn)錄組測序都采用poly-A捕獲和適度的測序深度，限制了我們對低豐度和非poly-A轉(zhuǎn)錄本的理解,，并使基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的組成部分難以實(shí)現(xiàn),。這里產(chǎn)生的數(shù)據(jù)使我們能夠系統(tǒng)地表征這些轉(zhuǎn)錄本，將這些轉(zhuǎn)錄物與前列腺癌的侵襲性臨床和病理特征聯(lián)系起來,。

許多研究報道了circRNAs調(diào)節(jié)其親本基因的線性產(chǎn)物（Abdelmohsen,，2017; Hansen，2013）。然而,，在被鑒定為增殖必需的90% 的circRNAs中,，它們的線性對應(yīng)物不是必需的，表明圓形轉(zhuǎn)錄物的獨(dú)立功能,。盡管進(jìn)行了廣泛研究,，但線性豐度的調(diào)節(jié)可能僅僅是circRNAs功能的一個子集。與此一致,，circRNAs顯示出來自線性對應(yīng)物的獨(dú)特預(yù)后信息,，暗示了其獨(dú)特的臨床作用。對于大多數(shù)circRNAs,，限制shRNA設(shè)計以包含反向剪接位點(diǎn)對于確保環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物的明確KD是必要的,。然而，這種限制不可避免地導(dǎo)致重疊的shRNA,，這可能會偏離篩選結(jié)果,。隨著技術(shù)成熟，諸如基于RNA的CRISPR測定的方法可用于未來的交叉驗證研究,。

已知circRNAs可作為miRNA海綿作用（Chen,，2016）。最近,，已經(jīng)為ciRS-7提出了另一種穩(wěn)定機(jī)制（Piwecka,，2017）。我們的研究支持miRNA穩(wěn)定機(jī)制的證據(jù),。然而,，功能性相互作用，穩(wěn)定的普遍性和潛在的機(jī)制仍有待闡明,。值得注意的是,，miR-181b / d的調(diào)節(jié)部分傳遞了circCSNK1G3的功能; 類似地，除了circCSNK1G3之外的miR-181b / d相互作用可以同時存在,。

總之,，我們首次報道了局部前列腺癌中具有功能注釋的circRNAs轉(zhuǎn)錄圖譜，并為未來的轉(zhuǎn)錄組研究提供了豐富的資源,。這些數(shù)據(jù)突出了原發(fā)性腫瘤的深度RNA-seq分析的價值,，特別是使用檢測非poly-A轉(zhuǎn)錄物的方案。

主要圖表分析

Fig1. 局部前列腺癌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征
(A)在144個前列腺腫瘤轉(zhuǎn)錄組中檢測到rna的分布(n = 38,359),。頂部條形圖表示檢測到的rna數(shù)量的百分比,；底部的圖顯示了每一個RNA的中位豐度(調(diào)整后的FPKM = log2(FPKM + 1)除以樣本百分比。在計算中位數(shù)時省略了遺漏的值,。點(diǎn)顏色表示豐度十分位,，其中十分位1包含最豐富的rna和十分位10是最不豐富的。 (B) 144個樣本中檢測到的rna中位豐度分布(n = 18152)。 (C)樣本(K = 5)和RNA (K = 5)亞型是對144個樣本進(jìn)行共聚分析發(fā)現(xiàn),，根據(jù)四分位排列的前25%的RNA (n = 4,582),。每個患者的臨床協(xié)變量顯示在右側(cè)的協(xié)變量欄中。(D)在原發(fā)區(qū)域,，每一行代表在10%以上的樣本中識別出的融合基因,，每一列代表一名患者。底部:臨床病人的特點(diǎn),。主區(qū)域中的顏色表示支持融合的證據(jù)行，三角形表示事件是否是通讀融合,。樣本按照上述條形圖所示的重復(fù)融合基因數(shù)量進(jìn)行排序,。右:點(diǎn)圖表示融合是否顯著共同發(fā)生的或相互排斥的。底部的熱圖顯示了融合事件和臨床協(xié)變量之間的關(guān)系,。(E)在超過10%的SU2C轉(zhuǎn)移性轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)融合,。與(D)相似，原發(fā)區(qū)域為融合患者相鄰條形圖表示融合隊列的比例,。右邊的條形圖顯示了所進(jìn)行的富集和缺失試驗在這兩個隊列之間的意義,。

Fig2. 前列腺癌環(huán)狀RNA的鑒定與表征
(A)鑒定高置信度環(huán)狀RNA。藍(lán)色和紫色分別代表前列腺癌患者腫瘤(n = 144)和細(xì)胞系(LNCaP,、V16A,、22Rv1和pc -3)中識別的環(huán)狀RNA (BSRR2)。綠色為RNaseR處理樣品中富集1.5倍以上的環(huán)狀RNA,。 (B)從患者樣本中鑒定出的組織/細(xì)胞類型特異性環(huán)狀RNA,。黑色和白色代表相應(yīng)研究中circRNA的存在和缺失。每一列代表一組20個環(huán)狀rna,，具有相同的存在模式,。協(xié)變量表示來自高置信度集合(上)和研究信息(右)的circRNA。 (C)環(huán)狀RNA存在模式在(B).  (D)每個樣本中檢測到的親本線性,、全線性和基因水平上的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本比例的分布(STAR方法),。親本與線性、線性與環(huán)狀Mann-Whitney U檢驗p值分別為9.5 x10-49和3.8 x10-16;CLESs分別是0和0.22,。 (E)預(yù)測環(huán)狀RNA親本基因的8個基因組和功能特征的單變量分析結(jié)果,。條形圖顯示FDR校正的p值;分段表示曲線下面積(AUC)， CI為95%,。(F)待用數(shù)據(jù)集隨機(jī)森林預(yù)測的ROC曲線,，95% CI: 0.85-0.88(10,000次迭代均值)。(G)環(huán)狀RNA及其線性對應(yīng)物與環(huán)狀RNA平均豐度的相關(guān)性,。Kendall’s tau及其p值與環(huán)狀RNA的平均豐度及其與親本基因的相關(guān)性有關(guān),。(H) circRNA與其線性對應(yīng)物的最大log2轉(zhuǎn)換比在樣本間的分布。無論環(huán)狀RNA的豐度是否顯著高于線性環(huán)狀RNA，環(huán)狀RNA分別被歸為顯性環(huán)狀RNA和非顯性環(huán)狀RNA,。插圖顯示兩種環(huán)狀RNA的log2均值FPKM

Fig3. 環(huán)狀RNA的失調(diào)與前列腺癌的進(jìn)展有關(guān)
(A) 144個CPCGENE腫瘤的相對circRNA豐度,，以circRNA Z評分表示?；颊甙碈RI增加程度進(jìn)行分級,，分為四分位組(Q1-Q4)。(B&C)穩(wěn)定(Q2, Q3)和極端(Q1, Q4) CRI的無BCR率比較CPC基因(B)組和NGS-ProToCol (C)組,。HR和95% CIs(括號內(nèi)數(shù)字)顯示了極端情況下的隊列,。對于NGS-ProToCol數(shù)據(jù)集，使用BCR注釋的樣本(n = 40),。(D)作為CRI功能的轉(zhuǎn)移性疾病在合并隊列中的分布(超幾何檢驗),。(E)CPC基因數(shù)據(jù)集中轉(zhuǎn)錄本豐度與BCR的關(guān)系。y軸和x軸分別表示環(huán)狀RNA的HR值和線性對應(yīng)的HR值,。

Fig4. shRNA篩選及必需環(huán)狀RNA的驗證
(A) shRNA靶向策略示意圖,。 (B)文庫中每個線性或環(huán)狀RNA靶點(diǎn)的shRNA數(shù)目。(C) V16A細(xì)胞系中比較T0和T8樣本的所有環(huán)狀RNA,、線性轉(zhuǎn)錄本以及陽性和陰性對照的負(fù)log10(p值)累積分布,。p值(Mann-Whitney U檢驗)相對于所有線性組(紅線)(CLES = 0.86)。(D) V16A細(xì)胞系的log2轉(zhuǎn)化倍數(shù)變化(log2(FC)),。x軸和y軸分別表示相對于T0,，T8的比較以及T16的比較。Spearman’s r的p值<2.2 x10-16,。 (E)確定的必需環(huán)狀RNA數(shù)目,。確定重要性是為了使每個circRNA在至少一次比較中p值小于0.01。 (F) shRNA篩選后不同細(xì)胞系中線性環(huán)狀RNA和環(huán)狀RNA的缺失,。熱圖顯示了171種必需環(huán)狀RNA中的152種以及相應(yīng)的線性環(huán)狀RNA,。顏色代表T0的 log2(FC)比值，紅色和藍(lán)色陰影分別代表陰性(貧化)和陽性(富集)值,。（G）4個細(xì)胞系中10種必需環(huán)狀RNA的增殖分析,。 L,LNCaP;V, V16A;R, 22Rv1; P, PC-3。底紋表示p值,，點(diǎn)的大小和顏色表示處理與對照的log2(FC)比值,。合并兩個KD復(fù)制，使FC均值和p值較大,。 (H) Achilles項目LNCaP CRISPR篩選數(shù)據(jù)中基因-log10(p值)的累積分布(Aguirre et al.,，2016)。虛線表示p = 0.05,。

Fig5. circCSNK1G3的功能表征
(A) circCSNK1G3基因組區(qū)域示意圖,。CSNK1G3基因(ENST00000345990.8)最長的轉(zhuǎn)錄本包含13個外顯子,。弧線表示生成circCSNK1G3的外顯子區(qū)域,。(B) CPC基因隊列中circCSNK1G3和CSNK1G3的豐度,。(C) circCSNK1G3 KD與OE樣品差異表達(dá)的基因。(D) circCSNK1G3激活的基因與CSNK1G3激活的基因重疊(超幾何檢驗),。(E和F) (E) circCSNK1G3-和(F) CSNK1G3-activated genes十大富集基因本體項,。背景陰影指示FDR。

Fig6. miR-181b/d部分挽救了circCSNK1G3的缺失
(A) circCSNK1G3與miRNA的相關(guān)性,。預(yù)測與circCSNK1G3相互作用的miRNA用紅色突出顯示,。(B) miRNA結(jié)合位點(diǎn)在circCSNK1G3上的圖示。保守由100-way PhastCons評分表示,。 (C)使用生物素化的circCSNK1G3和miRNA檢測RNA下調(diào),。U6和miR-7作為對照。 (D)使用生物素化的miR-181b/ D模擬物下調(diào)RNA并檢測circCSNK1G3,。豐度水平歸一化為生物素化模擬對照。(E) miR-181b/d過表達(dá)后circCSNK1G3,、CBX7,、CDK1、CDC25A豐度,。GAPDH作為對照,。(F) 在RNA-seq數(shù)據(jù)中，沉默circCSNK1G3后CBX7,、CDK1,、CDC25A豐度。數(shù)據(jù)表示來自兩個shRNA的平均值,。(G) miR-181b/d OE及circCSNK1G3 KD后細(xì)胞增殖情況,。與siCtrl + mimic Ctrl相比siCtrl + miR-181b/d mimic的p值，與siCSNK1G3 + mimic Ctrl相比siCSNK1G3 + miR-181b/d mimic的p值,，分別為4.6 x10-8和5.2 x10-8 (t檢驗),。

參考文獻(xiàn)：

Chen, S., et al. Widespread and Functional RNA Circularization in Localized Prostate Cancer. Cell 176, 831-843 e822 (2019).