用氣相色譜儀對篩選的 20 名血液透析患者的糞便進行短鏈脂肪酸測定,，得出結果如表 3-2 所示：基線 V0,、干預 V2、V6 期兩兩時期的乙酸,、丙酸,、丁酸、異丁酸,、異戊酸的對比的顯著性差異,，可看到 V0 和 V2 期的乙酸含量、丙酸含量有顯著性差異（P=0.011,、0.035<0.05）,，V2 期和 V6 期的丁酸含量有顯著性差異（P=0.045<0.05），其它均無顯著性差異,。

　　3.3.2 益生菌和短鏈脂肪酸相關性分析,。

　　如表 3-2 所示，益生菌攝入對腸道短鏈脂肪酸（short chain fatty acids,SCFAs）代謝水平的影響,。短鏈脂肪酸又名揮發(fā)性脂肪酸,，這類脂肪酸的碳鏈長度在 1-6之間，常見的短鏈脂肪酸包括乙酸,、丙酸和丁酸,。其主要由結腸中的厭氧菌發(fā)酵碳水化合物或降解蛋白質產生。短鏈脂肪酸在人體內具有重要的生理功能,，其可以調節(jié)人體的腸道菌群多樣性,、為腸道上皮細胞提供營養(yǎng)物質并促進腸道細胞的増殖、減少結腸炎癥的發(fā)生,、抗腫瘤等[88–90],。腸道內的益生菌能夠滿足需要時，就可以對腸道菌群失調進行改善,；之后在體內分解,，其有效成分能夠被人體吸收，從而促進腸道菌群之間的作用,，最終對增強人體免疫力有所作用[91],。

　　2005 年 Schneider 等人以患有腸道疾病的實驗對象和健康實驗對象為實驗對象，讓上述兩組人群連續(xù) 6 天攝入益生菌布拉氏酵母菌研究攝入該益生菌兩組人群腸道中短鏈脂肪酸的變化。結果發(fā)現(xiàn),，攝入益生菌后,，患病組實驗對象腸道中短鏈脂肪酸生成量顯著增加，健康組實驗對象沒有特別大的變化,。益生菌對樣品糞便中的乙酸,、丙酸、丁酸含量有影響,，并以 V2 期最為顯著,。說明在干預兩個月以后達到益生菌對短鏈脂肪酸的影響。

　　3.3.3 血液透析便秘患者糞便 16s 高通量測序分析,。

　　3.3.3.1 數(shù)據(jù)質控,。

　　（1）測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計,。

　　數(shù)據(jù)去雜方法和參數(shù)：① 濾 reads 尾部的質量值是 20 以下的堿基,，設置 50bp 的窗口且平均質量值低于20，就從窗口開始截去后端堿基,，之后再過濾質控后 50bp 以下的 reads,，去除含 N 堿基的 reads；② 根據(jù) PE reads 之間的 overlap 關系,，將成對 reads 拼接(merge)成一條序列,，最小 overlap 長度為 10bp；③ 接序列的 overlap 區(qū)可以允許為 0.2 的最大錯配比率,，以用來篩選出不符合的序列,；④ 基于序列首尾兩端的 barcode 和引物區(qū)別樣品，然后調整序列方向,，barcode允許的錯配數(shù)為 0,，并且最大引物錯配數(shù)為 2,；使用軟件：FLASH,、Trimmomatic。

　　（2）樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計,。

　?、贉y序數(shù)據(jù)統(tǒng)計以 16s 基因序列為基礎的測序方法，用來比較血液透析患者和干預 V2,、V6時期為對照組的腸道微生物群落,。從他們的糞便樣本中提取 DNA，表 3-3 所示共獲得 2226553 個高質量的 16srDNA 基因序列,，平均每個樣本序列為 37109 條基因序列,，樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計量最大序列為 44551 條，最小序列為 30055 條，樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計信息見附錄三,。

　?、跇颖緮?shù)據(jù)統(tǒng)計樣本信息的總覽，包括樣本和測序相關信息,，附錄 3,。

　　3.3.3.2 物種注釋與評估。

　　OUT 的定義是在系統(tǒng)發(fā)生學或群體遺傳學研究中,，為了便于進行統(tǒng)計分析,，人為的給某一個分類單元（品系，屬,，種,、分組等）設置了統(tǒng)一的標志。然后將序列按照彼此相似性分類和歸納為許多不同的小組,，進行聚類分析操作,，其中一個 OTU 就是一個小組?；谙嗨贫人降牟煌?，對所得序列進行 OTU 分類，一般是相似水平為 97%的條件下的 OUT 進行生物信息統(tǒng)計分析,。分析步驟如下：

　?、?為了便于降低分析中間過程中冗余計算量，要對優(yōu)化的序列再提取非重復序列,；② 去除沒有重復的單序列,；③ 按照 97%相似性對非重復序列來進行 OTU 聚類，在聚類過程中要去除嵌合體,，從而得到 OTU 的代表序列,。采用 RDP classifier 貝葉斯算法，然后利用這種算法對 97%相似水平的 OTU 代表序列進行分類學分析,，得到每個 OTU 對應物種的分類信息,，然后分別在各個分類學水平下顯示出來：domain（域），kingdom（界）,，phylum（門）,，class（綱），order（目）,，family（科）,，genus（屬），species（種）進而統(tǒng)計各樣本及其各樣本之間的群落組成及差異,。

　　利用 16s 細菌數(shù)據(jù)庫整理功能基因數(shù)據(jù)庫,，得出結果,。

　　（1）OTU 分類學分析。

　　OTU 分類學綜合信息表,， 將 OTU 分析結果分類學信息結合得到的綜合表,，Rank-Abundance 曲線是分析多樣性的一種方式。其構建方法是要對單一樣本中每一個 OTU 所含的序列數(shù)進行統(tǒng)計,，然后將 OTUs 按相對豐度由大到小進行排序,，以樣本 OTU 等級為橫坐標，以 OTU 中序列數(shù)的相對百分含量或序列數(shù)為縱坐標進行做圖,。

　　（2）Alpha 多樣性分析,。

　　微生物的多樣性是可以通過單樣本的多樣性來分析，反映了微生物群落的相對豐度和微生物的多樣性,。多樣性指數(shù)分析是統(tǒng)計顯示了個樣本在各個指數(shù)類型下的多樣性指數(shù)數(shù)值,，多樣性指數(shù)表第一列為樣本名，第一行為多樣性指數(shù)類型,，其余列為各指數(shù)類型對應的數(shù)值,。本研究選取能計算群落多樣性（Communitydiversity）的 shannon 相濃指數(shù)進行分析，圖 3-3 多樣性指數(shù)柱狀圖為 Shannon 均勻度測量指數(shù)分既指數(shù)越高代表菌群越豐富,，顯示基線 V0 期,、干預 V2、V6 期相比菌群多樣性差異并不明顯,。

　　（3）指數(shù)組間差異檢驗,。

　　通過多樣性指數(shù)分析可以得到群落中物種的豐度、覆蓋度和多樣性等信息,。T檢驗,，也稱 Student t 檢驗，是用 t 分布理論來推論差異發(fā)生的概率,，從而比較兩個平均數(shù)的差異是否顯著,，主要用于樣本含量較小（例如 n<30）,，總體標準差σ未知的正態(tài)分布數(shù)據(jù),。該分析可用于評估不同分組間多樣性指數(shù)是否有顯著性差異。

　　如圖 3-4 所示顯示,，按時期和各個醫(yī)院各個時期分析,，組間無顯著差異，說明組內差異較大,。多樣性指數(shù) T 檢驗柱狀圖，此圖展示所選兩組樣本間的顯著性差異情況,，并對有顯著性差異的兩組做好標記（0.01<p<=0.05 標記為*,，0.001<p<=0.01 標記為**,，p<=0.001 標記為***）。

　　3.3.3.3 物種組成分析,。

　　研究環(huán)境中微生物的多樣性,，可以通過單樣本的多樣性即 alpha 多樣性反映微生物群落的豐度和多樣性，也包括一系列統(tǒng)計學分析指數(shù)以估計環(huán)境群落的物種豐度和多樣性,。

　　此模塊主要有三個分析功能,，分別是 Alpha 多樣性指數(shù)分析、基于多樣性指數(shù)的組間 T 檢驗分析還有稀釋性曲線分析,，通過多樣性指數(shù)分析您可以得到群落中物種的豐度,、覆蓋度和多樣性等信息，通過稀釋性曲線分析您可以了解樣本的測序深度是否合理,。

　　（1）物種 Venn 圖分析,。

　　Venn 圖可用于統(tǒng)計多組或多個樣本中所共有和獨有的物種數(shù)目，可以比較直觀的表現(xiàn)樣本的物種數(shù)目組成的相似性和重疊情況,。一般情況下,，分析時選用相似水平為 97%的 OTU 或其他分類學水平的樣本表進行分析。

　　如圖 3-5 所示基線 V0 期,、干預 V2,、V6 期三個時期的菌群數(shù)量為 577 個，基線 V0 期,、干預 V2 期共有菌群數(shù)為 614 個,，基線 V0 期、干預 V6 期共有菌群數(shù)為606 個,，干預 V2 期,、干預 V6 期共有菌群數(shù)為 596 個，只有基線 V0 期有的菌群為12 個,，只有干預 V2 期有的菌群為 6 個,，只有干預 V6 期有的菌群為 16 個。Venn圖,，重疊部分表示多個樣本分組中共有的物種（或 OTU）,，沒有重疊的部分表示該樣本分組所特有的物種（或 OTU），數(shù)字表示對應的物種（或 OTU）數(shù)目,。

　　（2）群落組成分析,。

　　基于分類學分析的結果，顯示一個或多個樣本在不同分類水平上的分類學比對情況,。在結果中,，通常包含了兩個信息：

　　① 本中含有何種微生物,；② 樣本中的微生物的序列數(shù),，也可看作為各微生物的相對豐度,。

　　可采用使用統(tǒng)計學分析的方法，對樣本在不同分類水平上的群落結構以及其變化情況將多個樣本的群落結構放在一起分析對比進行觀測,?；谘芯繉ο蟮臉颖緮?shù)量，有不同的方式展示來展示結果,。一般使用比較直觀的餅圖或柱狀圖等形式進行呈現(xiàn),。除此之外群落結構可在任一分類水平下進行分析。

　?。?）群落 Bar 圖,。

　　基于分類學分析結果，顯示得出不同分組也可以是不同樣本在各分類水平（如域,、界,、門、綱,、目,、科、屬,、種,、OTU 等）上的群落結構組成情況。根據(jù)群落Bar 圖,，可以直觀呈現(xiàn)兩方面信息：

　?、俑鳂颖驹谀骋环诸悓W水平上含有何種微生物；②樣本中各微生物的相對豐度（所占比重）,。

　?、廴郝渲螆D，橫坐標/縱坐標為樣本名,，縱坐標/橫坐標為物種在該樣本中所占的比例,，不同顏色的柱子代表不同的物種，柱子的長短代表該物種所占比例的大小,?？梢酝ㄟ^點擊圖例中的每個物種進行篩選個性化查看物種組成情況。

　　如圖 3-6 所示,，在屬水平下基線 V0 期,、干預 V2、V6 期的腸道菌群中相對豐度大于 1%的微生物有 26 種,，分別為 Megamonas,，Coprococcus_2，F(xiàn)usobacterium,，Lachnospira ,， Roseburia ,， Collinsella ,， Alistipes ,， Parabacteroides ，Phascolarctobacterium ,， Lactobacillus ,， [Ruminococcus]_gnavus_group ，[Ruminococcus]_torques_group ,， Fusicatenibacter ,， Escherichia-Shigella ，Subdoligranulum ,，Ruminococcus_2 ,， Enterococcus ， [Eubacterium]_hallii_group ,，[Eubacterium]_rectale_group ,， Streptococcus ， Anaerostipes ,， Prevotella_9 ,，Bifidobacterium，F(xiàn)aecalibacterium,，Bacteroides,，Blautia。其中屬于厚壁菌門有 18種,、擬桿菌門 5 種,、變形菌門 2 種、梭桿菌門 1 種和變形菌門一種,。厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌,。

　　基線 V0 期中，厚壁菌門（53.9%）包括棲糞桿菌屬（Faecalibacterium,9.0%）,、布勞特氏菌屬（Blautia,13.69%）,，罕見小球菌屬（Subdoligranulum,3.42%），霍氏 真 桿 菌 屬 （ [Eubacterium]_hallii_group ,3.59% ） ,， 直 腸 真 桿 菌 屬（[Eubacterium]_rectale_group ,3.78%）,，丁酸弧菌屬（Anaerostipes,4.97%）、羅斯氏菌屬（Roseburia,0.78%）,、毛螺菌屬（Lachnospira,0.75）,、乳酸菌屬（ Lactobacillus,1.49% ） ， 腸 球 菌 屬 （ Enterococcus,0.23% ） ,， 鏈 球 菌 屬（ Streptococcus,2.95% ）,、巨單胞菌屬（ Megamonas,0.16% ）和考拉桿菌屬（ Phascolarctobacterium,0.92% ） ,。 擬 桿 菌 門 （ 13.8% ） 包 括 擬 桿 菌 屬（Bacteroides,10.33%），普雷沃氏菌屬（Prevotella_9,2.36%）,、Alistipes（1.04%）和副桿狀菌屬（0.07%）,。放線菌門（6.44%）包括雙歧桿菌屬（Bifidobacterium,5.7%）和，柯林斯氏菌（Parabacteroides,0.74%）,。最后兩個為變形菌門下的腸桿菌（Escherichia-Shigella,3.2%）和梭桿菌門下的梭桿菌（Fusobacterium,0%）,。

　　與基線 VO 期相比服用菌片干預兩個月后，厚壁菌門（49.52%）有所減少,，棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）,、羅斯氏菌屬（Roseburia）、毛螺菌屬（Lachnospira）和布勞特氏菌屬（Blautia）有所增加,，上升到 10.34%,、1.17%、1.06%和 14.2%,，罕見小球菌屬（Subdoligranulum）,、霍氏真桿菌屬（[Eubacterium]_hallii_group）和直腸真桿菌屬（[Eubacterium]_rectale_group）下降到 1.40%、1.94%和 2.39%,，乳桿菌屬（Lactobacillus）下降至 0.99%,，鏈球菌屬（Streptococcus）是上升至 3.72%，巨單胞菌屬（Megamonas,0%）下降,，腸球菌屬（Enterococcus,0.2%）,，羅斯氏菌屬（Roseburia,1.17%）增加。擬桿菌門相對豐度上升到 21%,，擬桿菌屬（Bacteroides）和普雷沃氏菌屬（Prevotella_9）上升到 14.48%和 6.52%,。放線菌門（5.68%），雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）下降到 3.82%,，腸桿菌屬下降到 1.86%,。

　　相較于干預 V2 期，菌片干預六個月后,，厚壁菌門（44.8%）含量繼續(xù)下降,，包括棲糞桿菌屬（Faecalibacterium,6.32%）、布勞特氏菌屬（Blautia,11.5%）,，罕見 小 球 菌 屬 （ Subdoligranulum,1.64% ） ,， 霍 氏 真 桿 菌 屬（ [Eubacterium]_hallii_group ,1.80% ） ， 直 腸 真 桿 菌 屬（[Eubacterium]_rectale_group ,1.76%）,，丁酸弧菌屬（Anaerostipes,2.66%）均有所減少,，羅斯氏菌屬（Roseburia,0.43%）和毛螺菌屬（Lachnospira,0.45%）有顯著減少（P<0.05），腸球菌屬（Enterococcus）上升至 6.59%，鏈球菌屬（Streptococcus）持續(xù)上升至 2.43%,，乳桿菌屬（Lactobacillus）持續(xù)下降到 0.51%,，巨單胞菌屬（Megamonas,1.02%）增加，羅斯氏菌屬（Roseburia,0.43%）減少,。擬桿菌門下降至 17.57%,，擬桿菌屬（Bacteroides）和普雷沃氏菌屬（Prevotella_9）均有所下降，下降為 13.21%和 4.36%,。放線菌門（7.78%）增加,，包括雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）增長到 6.98%和腸桿菌（Escherichia-Shigella）持續(xù)下降至 1.16%,。

　　綜上所述,，普氏菌屬（Prevotella_9）、擬桿菌屬（Bacteroides）,、布勞特氏菌（Blautia）,、棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）、丁酸弧菌屬（Anaerostipes）為健康人腸道內普遍存在的菌群屬,，在口服益生菌片劑期間都有所增加,，雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、腸球菌屬和鏈球菌屬為腸道有益菌在干預時期有所增加,，乳桿菌屬持續(xù)減少,。

　　（4）群落 Heatmap 圖。

　　Heatmap 圖是以顏色梯度來表征二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)大小,，并呈現(xiàn)群落物種組成信息,。一般基于物種或樣本間豐度的相似性進行聚類分析，并將結果展現(xiàn)在群落 heatmap 圖上,，這使高豐度和低豐度的物種分塊聚集,，分類明顯，不同分組（或樣本）在各分類水平上的群落組成的相似性和差異性可以通過相似程度與顏色變化來反映,。群落 Heatmap 圖,，熱圖下側和右側分別為樣本名稱和 OTU 編號（或者物種名稱），如果進行了聚類分析左側和上側分別為物種聚類樹和樣本聚類樹,。熱圖中顏色的深淺分別代表 OTU（或者物種）豐度的高低,。

　　Heatmap 圖是以顏色梯度來呈現(xiàn)菌群中的物種組成信息，顏色的變化和相似程度體現(xiàn)了不同樣品中菌群組成的差異性和相似性,。通過 Bar 圖分析了服用益生菌片劑不同時期組血液透析患者腸道菌群的組成（見圖 3-6）,，接著利用群落 Heatmap圖（見圖 3-7）來觀察三個不同時期 20 名血透患者菌群結構的變化和差異性，并在科分類水平上運用 Students ’ T 檢驗分析不同處理組間的差異物種,，Heatmap圖中,，基線 V0 到干預 V6 紅色快和綠色快大部分呈緩慢變化趨勢，也有變化較大的色塊，尤其是以 Phyllobacteriaceae（ P=8.007E-09<0.01）,、Alcaligenaceae（P=0.04384<0.05）為代表（見圖3-4A）,。干預V2期中紅色色塊代表Bacteroidaceae、Nocardiaceae,、Verrucomicrobiaceae,、Fusobacteriaceae、Prevotellaceae 色塊顏色加深 ,， 相 對 豐 度 上 升 ,， 占 比 提 高 ， 綠 色 色 塊 代 表 Family_XIII ,、norank_o__Mollicutes_RF9,、Bacteroidales_S24-7_group 色塊顏色加深，相對豐度下降,， 占比減少,。干預 V6 組中以為 Bifidobacteriaceae、Bacteroidales_S24-7_group,、Verrucomicrobiaceae,、Fusobacteriaceae、Enterococcaceae 代表的紅色色塊顏色加深,，相對豐度上升,， 占比提高。

　　Heatmap 圖通過顏色梯度變化直觀地顯示了服用益生菌片劑不同時期組血液透析患者腸道菌群結構的差異,，干預 V2 組的色塊顏色和干預 V6 組都有所變化,，說明口服益生菌片劑兩個月促進腸道菌群結構的變化。從圖 3-4B 可以看出,，與基線 V0 組的 20 名血透患者腸道菌群相比,，口服益生菌片劑六個月后，血透患者腸道中 Phyllobacteriaceae（P=8.007E-09<0.01）相對豐度顯著下降,，腸球菌屬Enterococcus 比例下降（2.0%下降至 1.2%）,，未分類擬桿菌 Bacteroidales_S24-7（P=0.04<0.05）比例顯著降低，擬普雷沃菌 Alloprevotella 比例下降（P=0.054）,，葡萄球菌 Staphylococcus 比例下降（2.16%下降至 0.03%）,。

　　3.3.3.4 樣本比較分析。

　?。?）PLS-DA 分析,。

　　PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis)，即偏最小二乘法判別分析,，是多變量數(shù)據(jù)分析技術中的判別分析法,，經常用來處理分類和判別問題,。通過對主成分適當?shù)男D，PLS-DA 可以有效的對組間觀察值進行區(qū)分,，并且能夠找到導致組間區(qū)別的影響變量,。

　　利用 Alpha 多樣性分析初步證明了以口服益生菌片劑服用時期不同為分組對菌群多樣性無明顯關聯(lián)，本實驗接著進行樣本分組分析,，利用基于 OTU 水平下的PLS-DA 分析來比較口服益生菌片劑的不同時期為分組,，對篩選的 20 名血液透析便秘患者的腸道微生物群落組成的差異進行分析。如圖所示：樣本分組分析通過比較樣品間進化信息的差異得到距離矩陣,，直觀顯示不同樣品中微生物群落在進化上的差異性,。基于 OTU 水平下的 PLS-DA 分析在特定的進化譜系中挖掘影響環(huán)境樣品菌落組成差異的潛在主成分,，PLS-DA 圖,，樣本點的空間距離代表樣本間的距離。

　　如圖 3-8 所示,，PLS-DA 分析比較了未服用益生菌片劑 V0 期和服用益生菌片劑兩個月 V2 期和服用益生菌片劑六個月 V6 期血液透析患者腸道菌群組成的差異,。COMP1（3.71%）和 COMP2（4.61%）是總變異中權重最高的兩個主成分，散點的分布顯示樣本發(fā)生不明顯的區(qū)分,，與未服用益生菌片劑 V0 期相比，服用益生菌片劑兩個月 V2 期和服用益生菌片劑六個月 V6 期血液透析患者菌群結構差異較小,，都集中在 COMP1 軸中側偏左處,。此外，在 COMP2 軸上,，服用益生菌片劑兩個月 V2 期和服用益生菌片劑六個月 V6 期樣品左右分布,，說明口服益生菌片劑對腸道菌群起到了調節(jié)作用不明顯，而兩組樣本的點有個別交互的現(xiàn)象,，可能是由于選擇人群的個體有較大差異的情況下對腸道菌群的影響具有局限性,，所以服用益生菌片劑的兩個時期的菌群結構存在一定的共性。結果表明口服益生菌片劑調節(jié)腸道菌群結構效果不明顯,。

　　3.3.3.5 物種差異分析,。

　　物種差異分析根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù)，運用相關的分析方法進行分析,，檢測不同組（或樣本）微生物群落表現(xiàn)出的豐度差異,。 物種差異性分析模塊的內容包括：組間差異顯著性檢驗、Lefse 多級物種差異判別分析,。

　　組間顯著性差異檢驗根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù),，運用嚴格的統(tǒng)計學方法，對不同組（或樣本）微生物群落之間的物種進行假設檢驗,，評估物種豐度差異的顯著性水平,，獲得組（或樣本）間顯著性差異物種。該分析可在不同分類學水平下進行。

　　（1）多組比較,。

　　多組樣本指大于 2 組以上樣本之間物種的差異比較一般采用以下方法：

　?、?one-way ANOVA，又稱單因素方差分析,，可用于檢驗多組樣本的均值是否相同,。通過此分析可以比較物種在 3 組或 3 組以上樣本組中的分布是否存在顯著性差異，同時對有差異的特征進行 post-hoc 檢驗多組中存在差異的樣本組,。

　?、?Kruskal_Wallis 秩和檢驗，簡稱克氏秩和檢驗,，它是一個將兩個獨立樣本的 wilcox 秩和檢驗推廣到 3 個或更多組檢驗的方法,。是多組（大于等于 3）獨立樣本非參數(shù)檢驗的一種方法。該分析可以對多組樣本的物種進行顯著性差異分析,，并對 P 值計算假發(fā)現(xiàn)率 q 值,，單物種比較柱形圖，縱坐標表示不同分類水平下的物種名,，橫坐標表示該樣本的某一物種豐度的百分數(shù)數(shù)值,，不同顏色表示不同分組。

　　如圖 3-9 所示,，在屬水平下進行基線 V0 期與干預 V2,、V6 期的三組的腸道菌群群落進行比較分析。布勞特氏菌屬(Blautia),、Faecalibacterium,、胃瘤球菌屬([Ruminococcus]_torques_group)干預 V2 期增加，三組比較呈減少趨勢,；普雷沃氏菌屬(Prevotella_9)在干預 V2 期增加,，且三組比較有所增加；雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)干預 V2 期減少,，干預 V6 期增加,，三組比較呈增加趨勢；Anaerostipes ,、 直 腸 真 桿 菌 屬 ([Eubacterium]_rectale_group) ,、 霍 氏 真 桿菌 屬([Eubacterium]_hallii_group) 、 埃 希 菌 屬 (Escherichia-Shigella) ,、 紡 錘 鏈 桿 屬(Fusicateibacter)三組比較呈逐漸減少趨勢,；鏈球菌屬(Streptococcus)干預 V2 期增加，干預 V2 到干預 V6 期減少,，三組比較無變化,；Ruminococcus_2 干預 V2 期減少,，干預 V6 期無變化，總體減少,；Subdoligranulum 干預 V2 期減少,，干預 V6 期增加，總體減少,；Enterococcus 干預 V2 期無變化,，干預 V2 到干預 V6 期增加，總體 增 加 ,。 可以 表 明口 服 益 生菌 片 劑 第二 個 月布 勞 特 氏菌 屬 (Blautia) ,、Faecallbacterum 、 胃 瘤 球 菌 屬 ([Ruminococcus]_torques_group) ,、 擬 桿 菌 屬(Bacteroides),、普雷沃氏菌屬(Prevotella_9)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium),、鏈球菌屬(Streptococcus)增加,，第六個月有所維持或減少，干預 V2 期和干預 V6 期相比有效果,，但三組腸道菌群比較均無顯著性差異,，說明益生菌片劑對干預 V6 期血液透析患者腸道菌群的調節(jié)作用不明顯，導致三組比較無顯著差異菌,。

　　（2） 兩組比較,。

　　選擇的兩組樣本之間物種的差異比較一般采用以下 3 種方法：

　　T 檢驗，又稱 Student’s t-test(equal variance),、 Welch T 檢驗 (方差不等)，又稱 Welch’s t-test(unknow variance)和 wilcox 秩和檢驗（Wilcoxon rank-sum test）,，也叫曼-惠特尼 U 檢驗（Mann–Whitney U test）,，這些分析可以對兩組樣品的物種進行顯著性差異分析，并對 p 值進行多種方法的校正,多物種差異檢驗柱形圖,，縱坐標表示不同分類水平下的物種名,，橫坐標表示該樣本的某一物種豐度的百分數(shù)數(shù)值，不同顏色表示不同分組,。0.01<p<=0.05 *="" 0.001<="" p="" <="0.01" **=""p<="0.001" ***<="">,。

　　如圖 3-10-1 所示，基線 V0 期和干預 V2 期在目水平下的菌群群落顯示,，擬桿菌目（Bacteroidales（）P<0.05）具有顯著性差異.,，干預 V2期擬桿菌目（Bacteroidales）水平顯著提高。如圖 3-10-2 所示,，基線 V2 期和干預 V6 期在綱水平下的菌群群落顯示,，變形菌目（Alphaproteobacteria）（P<0.01）具有極大顯著性差異,。如圖 3-10-3所示，基線 V0 期和干預 V6 期在綱水平下的菌群群落顯示,，β-變形菌（Betaproteobacteria）(P<0.05)具有顯著性差異,，藍細菌（Cyanobacteria）（P<0.01）具有極大顯著性差異差異，變形菌（Alphaproteobacteria）（P<0.01）具有極大顯著性差異,。

　　3.3.3.6 關聯(lián)與模型預測分析,。

　　（1）環(huán)境因子相關性 Heatmap 圖,。

　　采用監(jiān)督式多元分析方法,，引入樣本環(huán)境因子信息與群落豐度進行分析，研究環(huán)境因子與物種,、樣本之間的相互影響的關聯(lián)關系,。可以用熱圖直觀的展現(xiàn)數(shù)值矩陣,相關性熱圖,，熱圖的 X 軸和 Y 軸分別為環(huán)境因子和物種（或 OTU）,，通過計算獲得 R 值和 P 值。R 值在圖中以不同顏色展示,，熱圖右側色卡是不同 R 值的顏色分區(qū),。0.01<p<=0.05 *="" 0.001<="" p="" <="0.01" **="" p<="0.001"***<=""> 。

　　如圖 3-11 所示,，藍細菌門（Cyanobaceria）和透析時間（time）呈顯著負相關,；疣微菌門（Verrucomicrobia）與水分含量(MC)和乙酸含量（Acetic）呈顯著負相關，與 pH,、腎病類型（type）和異戊酸含量（Isovaleric）呈顯著正相關,；擬桿菌門（Bacteroidetes）與尿酸（UA）呈顯著負相關，與 pH 呈顯著正相關,；unclassified_k_norank,、黏膠球形菌門（Lentisphaere）與透析時間呈顯著負相關；互養(yǎng)菌門（Synergistetes）與尿素（UREA）和 pH 均呈顯著正相關,；柔膜菌門（Tenericutes）與透析時間（time）,、乙酸含量（Acetic）和丙酸含量（Propionic）均呈顯著負相關；變形菌門（Proteobacteria）與丁酸含量(Butyric)呈顯著負相關,，與腎病類型（type）呈顯著正相關;梭桿菌門（Fusobacteria）與透析時間（time）呈顯著正相關;放線菌門（Actinobacteria）與異丁酸含量（Isobutyric）呈顯著負相關,；另外 WS6、Saccharibacteria,、厚壁菌門（Firmicutes）,、酸桿菌門（Acidobacteria）與透析時間（time）、水分含量(MC),、丁酸含量(Butyric),、乙酸含量（Acetic）,、丙酸含量（Propionic）、尿素（UREA）,、肌酐,、尿酸（UA）、pH,、腎病類型（type）,、年齡、異丁酸含量（Isobutyric）和異戊酸含量（Isovaleric）均無明顯相關性,。

　　（2）Random Forest 分析,。

　　隨機森林（Random Forest）屬于機器學習算法，是一個包含多棵決策樹的分類器,，它的分類結果根據(jù)檢測樣本的各個維度上的屬性,，在不同的決策樹上進行判定，綜合考慮所有判定結果后給出最終分類,，對于分類問題結果取概率最大值,，回歸分析則取概率均值，它可以高效快速挑選出對樣本分類最為重要的物種類別（biomarker）,。

　　采用隨機森林方法進行的 ROC 分析,，通過從預測集去除 OTU 引起誤差的增加的多少給每一個 OTUs 評估一個重要性的得分，根據(jù)表 3-4 共得到了 5 個OTUs,，其相對豐度能夠可靠的鑒別口服益生菌 V6 期與基線 V0 期對照的樣本,。這些有差異的 OTUs 主要集中在變形菌門和厚壁菌門。

　　3.3.4 益生菌和腸道菌群相關性分析,。

　　在門的水平上,，近些年國內外進任的一系列人口調查實驗均發(fā)現(xiàn)人體腸道菌群主要由硬壁菌門、擬桿菌門,、變形菌門和放線菌門構成,，隸屬于上述四個菌門的細菌占到了人體細菌總量的 99%上雖然在口的水平上各個國家地區(qū)的人群都主要由上述四個菌口構成，但具體到屬的水平上如前言部分所述,，不同時期的人們腸道菌群結構便開始出現(xiàn)較大的個體差異性，這說明人體腸道菌群的組成是極為復雜的,、在很大程度上也是受外界環(huán)境影響的,。

　　益生菌對腸道菌群的影響是多方面的，根據(jù)其對腸道菌群影響的機制不同,，可將這種影響分為直接影響和間接影響,。直接影響是指人體食用酸奶或菌片等富含益生菌的產品以后，益生菌能直接影響腸道菌群的結構,。間接影響是指攝入益生茜以后,，益生菌會對腸道菌群的代謝如短鏈脂肪酸的代謝和總膽汁酸代謝,，腸道細菌酶活力，腸道內礦物質的吸收等產生影響,。益生菌的攝入對體內腸道菌群的結構產生影響,。大量研巧表明，通過口服益生菌的方式可快速改變宿主腸道菌群的結構,。這可能是由于人們在攝入富含益生菌的產品后,，大量活性益生菌被直接送到人體腸道中，從而使腸道菌群的構成在短時間內產生了較大的變化,。除此之外,，益生菌進入腸道后會通過代謝作用，殺滅一部分致病茜,、并促進部分有益菌的生長,，這也會在一定程度上改變宿主腸道菌群的構成[76][92–95。

　　3.3.5 腸道菌群和短鏈脂肪酸相關性分析,。

　　如圖 3-3—圖 3-11,，表 3-3 和表 3-4 所示，腸道是人體最重要的新陳代謝器官,，腸道菌群直接的影響到人體的新陳代謝,。腸道菌群最主要的功能就是通過發(fā)酵碳水化合物實現(xiàn)能量的廢物利用，例如發(fā)酵難消化的食物殘羹（植物細胞壁,，纖維素和低聚糖）,，粘蛋白側鏈和脫落的上皮細胞。除了能量的廢物利用,，腸道微生物還利用產生的短鏈脂肪酸,，發(fā)酵產生氣體（氫氣、二氧化碳和甲燒）和生物量,，這些都直接影響腸道的生理機能,。腸道微生物的成分也用來合成某些族和族的維生素并能影響上皮細胞的表達，此外,，它們還通過代謝外源物質來保持氦基酸的內穩(wěn)態(tài),，并影響藥物的功效，這些都大大增強了宿主防御外源物質的能力,。

　　其中,，腸道微生物在人體結腸中通過發(fā)酵食物產生了人體所必須的短鏈脂肪酸主要有三種脂肪酸：乙酸、丙酸,、丁酸,。脂肪酸給細胞提供能量（乙酸供給肌肉，丙酸供給肝臟,，丁酸供給結腸細胞）,，影響結腸代謝,，控制上皮細胞的增值和變異。被鑒定為具有短鏈脂肪酸產生功能的勞特氏菌屬（Blautia）,、梭菌屬（Clostridium）,、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、羅斯氏菌屬（Roseburia）和罕見小球菌屬（Subdoligranulum）,，棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）,、擬桿菌屬（Bacteroides）。在腸道中主要的代謝產物為短鏈脂肪酸的菌屬及其代謝產生的短鏈脂肪酸的種類參見表 3-5：

　　3.4 本章小結,。

　　益生菌干預便秘改善,，從糞便短鏈脂肪酸的測定和 16s 高通量菌群測序結果分析來看，研究結果表明 V0 和 V2 期的乙酸含量,、丙酸含量有顯著性差異（P<0.05）,，V2 期和 V6 期的丁酸含量有顯著性差異（P<0.05），其它均無顯著性差異,；腸道內的優(yōu)勢菌門是厚壁菌門和擬桿菌門,，厚壁菌門持續(xù)減少，厚壁菌門大部分是專性厭氧菌,，維持腸道正常的營養(yǎng),、代謝及免疫功能，而擬桿菌門增加,，以往研究發(fā)現(xiàn),，血液透析會改變厚壁菌門的生存環(huán)境，利于擬桿菌門細菌生存和繁殖,。干預 V2 期的雙歧桿菌屬 Bifidobacterium 下降到 3.82%,。乳桿菌屬豐度下降，鏈球菌屬（Streptococcus）是上升至 3.72%,，巨單胞菌屬（Megamonas,0%）下降,，羅斯氏菌屬（Roseburia,1.17%）增加。到干預 V6 期雙歧桿菌屬 Bifidobacterium 增長到6.98%,，腸球菌屬（Enterococcus）上升至 6.59%,，鏈球菌屬（Streptococcus）持續(xù)上升至 2.43%，乳桿菌屬（Lactobacillus）持續(xù)下降到 0.51%,，巨單胞菌屬（Megamonas,1.02%）增加,，羅斯氏菌屬（Roseburia,0.43%）減少。雙歧桿菌屬和腸球菌屬豐度在干預六個月增加較多,，而其他腸道有益菌無較大改變。在干預期間變形菌門豐度上升,，腸道內有害菌增加不明顯,，導致腸屏障功能受損,。而藍細菌、互養(yǎng)菌門,、黏膠球形菌門對健康和疾病的影響未知,，需要進一步研究明確。

　　口服益生菌片劑六個月對腸道菌群改善來看,，腸道內的有益菌增多但有害菌或腸道其他環(huán)境并無較大抑制作用,。