.........（尷尬）

然而,，自己操作過這個實驗的同學就知道,，成功的ATAC-seq實驗結果會產生明顯的特征條帶，產生該條帶的原因是由核小體結構所決定的,，核小體free區(qū),、纏繞著1個核小體,，2個核小體,，以此類推，形成具有特征長度的DNA富集片段,。

但是,！想要成功的獲得理想的特征條帶，其實并沒有大家想象的“辣么簡單”,，在樣品處理過程中,，如果核小體發(fā)生不同程度的解聚，就會產生不同類型的DNA條帶,，如下圖所示,，列出了“完美成功（得意）”、“完美失?。ㄐ蓿钡葞追N結果,。

下面，小編就以切身體會和大家分享下決定ATAC-seq實驗成敗的那些“小事（細節(jié)）”,。

實驗第一步是制備單細胞懸液,，這里要說的是針對組織樣品，選取合適的制備方法很重要,，因為要盡可能的保留細胞核的完整性,，所以不同樣品對“力度”的掌控很有講究，裂解既要充分,，但又不可過度,。

① 液氮研磨的方法最快也最方便，但很難掌控力度,。一般提取DNA時需要充分研磨5分鐘左右,，但是針對ATAC-seq的樣品建議不要超過2分鐘，在液氮中組織樣品會變得很“脆”,，只需要敲打散開,，再研磨幾圈,，沒有明顯大顆粒即可。

② 對于體積較小的組織塊,，可以考慮使用Dounce勻漿器,。因為勻漿的時間一般要長于液氮研磨，且冰上操作的溫度不如液氮低,，因此這個過程核小體發(fā)生解聚的風險較大,，速度要快，時間不宜過長,。

③ 對于植物組織,，可采用原生質體法，但不同組織的細胞壁成分和含量會有差異,，用統(tǒng)一的酶消化可能會存在消化不足或過度的現(xiàn)象,。如果掌握好消化的條件，就可輕松獲得完整的原生質體了,。

得到完整的單細胞懸液后,，下一步是裂解細胞膜回收細胞核。NP40和Triton作為中性裂解液,，最大的特點是能充分裂解細胞膜而不破壞細胞核,，較多文獻中給出的條件只需裂解3分鐘，如果擔心裂解不充分,，可以延長到最多10分鐘,。回收到的細胞核內核小體若未發(fā)生隨機解聚,，切下的DNA則會呈現(xiàn)特征條帶,，call出的peak結果也會較好。

但是,！有的樣品含有豐富的糖和酚,，有的含有大量的脂肪，有的組織已經發(fā)生了纖維化,，需要通過添加特殊清洗試劑,、 增加清洗次數(shù)、梯度離心等方法去除這些雜質（細節(jié)我不告訴你（調皮））,，若不去除或未去除干凈,，就會嚴重影響細胞核的完整性和轉座酶的效率，最終導致實驗失敗,。

如果大量的DNA與核小體脫離,，則會切出彌散的條帶，從膠圖就能判斷出實驗失敗。如果原本緊密纏繞的核小體散開了,，但DNA仍然纏繞在核小體上,，那么最后可以得到清晰的特征條帶，但是call出的peak結果可能不好,，數(shù)據(jù)的可重復性可能不高,。

通過計算IDR peak反映數(shù)據(jù)的可重復性，從單樣本的數(shù)據(jù)中隨機抽取部分數(shù)據(jù)量重新進行call peak,，和原來的peak進行比對,。如果實驗過程中能使絕大部分細胞都保持同樣的開放狀態(tài)，那么抽取出來的少數(shù)據(jù)量也能得到和原來一樣的peak,。如果部分細胞的核小體發(fā)生了隨機性的解聚,，那么這些細胞之間的開放區(qū)域不一致，在隨機抽取少數(shù)據(jù)量時得到的可重復的peak就會變少,。同時雜峰會掩蓋正常的峰,，導致得到的peak數(shù)量也會降低。

這么看來,，組織樣品的ATAC-seq實驗很關鍵的環(huán)節(jié)就是樣品前處理,，包括研磨,、裂解,、除雜，在這些過程中要盡可能的保持核小體的完整性,，之后的酶切純化過程就顯得簡單了,，好的片段分布圖和高質量的peak檢測結果自然水到渠成。