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微生物多樣性測序介紹 16S rRNA基因存在于所有細菌的基因組中，是細菌編碼rRNA相對應的DNA序列,，其高度的保守性和特異性是細菌進化的“分子尺標”,。16S rDNA測序是指對樣品中的16S rRNA基因高變區(qū)進行PCR擴增及高通量測序的一種技術，廣泛應用于微生物群落的快速鑒定,。 在真核生物rDNA中,，轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS在進化過程中承受的自然選擇壓力小，能容忍更多的突變,，在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性,，選擇ITS進行高通量測序，有利于區(qū)分不同的真菌,。 微生物多樣性測序流程  ① 基因組DNA抽提和質(zhì)檢 依據(jù)不同樣本類型，使用相應的試劑盒進行抽提,，（不同樣本類型試劑盒使用建議：微生物樣本取樣方法和注意事項）,。DNA提取后，使用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳進行總DNA質(zhì)檢。 DNA樣本送樣要求： DNA樣品總量：單次建庫的量m≥250ng,，建議送2次建庫的量,，m≥500ng； DNA樣品濃度：c≥5ng/μL,，濃度以Qubit質(zhì)檢結果為準,； DNA樣品純度：260/280在1.8-2.0之間； DNA樣品完整性：DNA無降解,，即電泳有明顯的主帶,。 注：若老師自行提取并郵寄DNA樣本，請盡量提供純化好的DNA及DNA質(zhì)檢結果（電泳膠圖或Qubit/Nanodrop定量結果）,。 ② 引物設計并合成 細菌16S rDNA擴增選擇區(qū)域為V3-V4區(qū),，使用的通用引物為341F和806R（詳細內(nèi)容，請閱讀《16S測序及區(qū)域選擇小科普》）,；真菌擴增選擇區(qū)域為ITS2區(qū),，使用的通用引物為ITS3和ITS4。在通用引物的5’端加上適合Illumina PE250測序的index序列和接頭序列,，完成特異性引物的設計,。  參考文獻： [1] Conservative Fragments in Bacterial 16S rRNA Genes and Primer Design for 16S Ribosomal DNA Amplicons in Metagenomic Studies. [J] PLOS One, 2009. [2] ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. [J] BMC Microbiology, 2010. ③ PCR擴增和產(chǎn)物純化 以稀釋后的基因組DNA為模板，使用高保真酶進行PCR,，確保擴增的準確性,、特異性和高效性。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,，并用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物,。  圖1 16S rDNA PCR反應示意圖  圖2 ITS2 PCR反應示意圖 ④ PCR產(chǎn)物定量和均一化 文庫質(zhì)檢合格后，使用Qubit進行文庫定量,，并根據(jù)每個樣品的數(shù)據(jù)量要求,，進行相應比例的混合。 ⑤ Illumina測序 使用Illumina PE250進行上機測序,。  圖3 16S測序原理圖 (ITS流程圖類似) 擬解決的科學問題 基于二代高通量測序技術,，對細菌（16S）或真菌（ITS）的可變區(qū)序列進行測序，研究樣品中微生物的種類,，獲得樣品中微生物的群落組成和相對豐度,，探討微生物群落與環(huán)境之間的關系。 ① 物種組成分析 一般以柱狀圖的形式展示各個樣本或各組樣本在不同物種分類水平上優(yōu)勢物種的相對豐度,。文章中的描述一般是某水平上優(yōu)勢物種是什么,，其相對豐度是多少，例如門水平的優(yōu)勢物種分別是厚壁菌門,、變形菌門,、擬桿菌門……此外還可以根據(jù)菌群的屬性進行描述，如有害菌和有益菌的相對豐度是多少。  圖4 各樣本屬水平上優(yōu)勢物種 相對豐度組成柱狀圖  圖5 不同分組屬水平上優(yōu)勢物種 相對豐度組成柱狀圖 ② 物種多樣性分析 Alpha多樣性分析：Alpha多樣性包括物種組成種類和均勻度,。在數(shù)據(jù)分析或文章中有兩個用處： （1）用于評判測序深度是否可以覆蓋該樣本中的物種組成情況,，多出現(xiàn)在早期高通量測序文章中； （2）比較不同分組中物種多樣性的差異,。一般情況下,，健康組中的微生物多樣性高于疾病組，可能是疾病組中的一些致病菌的豐度增加,，對其它的菌群有一定的抑制作用,。此外也有一些疾病類型是疾病組的微生物多樣性高于健康組，如陰道類型的疾病,、帕金森疾病等,。詳細內(nèi)容，請閱讀《學好物種多樣性分析,，要從Alpha多樣性抓起,！》！  圖6 各樣本Alpha多樣性chao1指數(shù)稀釋曲線圖  圖7 A組和B組shannon指數(shù)差異分析 Beta多樣性分析：用于比較不同分組間微生物群體整體組成是否有差異,，是一個量化的數(shù)值,，其值的大小反映每個組內(nèi)各個樣本間微生物群落組成的差異，其中Unifrac算法是基于物種之間進化距離計算,，考慮物種的豐度為weighted,，不考慮物種豐度為unweighted。（備注圖9~圖12均可以采用weighted和unweighted進行分析）,。詳細內(nèi)容,，請閱讀《微生物β多樣性，組間比較的利器》,！  圖8 各樣本間物種組成差異分析  圖9 組間差異與組內(nèi)差異比較Anosim分析 圖10 PCA分析 圖11 PCoA分析 ③ 差異物種分析 差異物種分析描述某些物種在不同分組中的富集情況,，例如與對照組比較，某些在疾病中顯著富集的菌群是條件致病菌,，與研究的客觀情況相符合,。差異物種分析的方法主要有：秩和檢驗、STAMP分析和LEfSe分析,。其中秩和檢驗和STAMP分析顯示某特定水平上物種的差異,，LEfSe分析可以全面的顯示各個水平上物種組成的差異。詳細內(nèi)容,，請閱讀《差異微生物/基因在哪里,？四款分析方法來相助》！ 圖12 差異物種LEfSe分析 圖13 差異物種STAMP分析 ④ 功能預測 為了能夠通過16S測序數(shù)據(jù)來準確的預測出功能構成,，首先需要對原始16S測序數(shù)據(jù)的種屬數(shù)量進行標準化,；然后將16S的種屬構成信息通過構建好的已測序基因組的種屬功能基因構成表映射獲得預測的功能結果,；再基于功能預測的結果進行差異分析或相關性分析等。詳細內(nèi)容,，請閱讀《16S/ITS功能預測 | PICRUSt等5款軟件帶你上車》和《差異物種與代謝通路關聯(lián)分析》！ ⑤ 相關性分析 物種與物種之間相關性分析,，用來描述物種之間的互作關系,。一般情況下健康人的微生物互作關系較強，疾病狀態(tài)可能因為菌群紊亂,，某些致病菌豐度增加,，導致了微生物的互作關系減弱。物種與環(huán)境因子之間的相關性分析或物種與代謝通路間的相關性分析等有助于更好的揭示某種現(xiàn)象,，解釋某種機制,。詳細內(nèi)容，請閱讀《跟著Spearman進入相關性分析世界》和《MaAsLin | 教你分析微生物豐度相關性》,！ 圖14 差異物種之間的互作分析 圖15 差異物種與代謝通路的相關性分析 圖16 物種與環(huán)境因子之間的RDA分析 圖17 物種對代謝通路的貢獻分析 ⑥ 個性化分析 結合特定的研究內(nèi)容會開展一些個性化的分析,，以增加分析亮點，如研究疾病與菌群的分析,，基于一些算法挑選疾病的微生物標記物,，用標記物做疾病診斷模型，對臨床研究有重要意義,；研究嬰兒菌群組成的影響因素,，會測定環(huán)境、母親生殖道,、母親皮膚等微生物的組成,，做溯源分析，研究嬰兒菌群組成的污染比例,。 圖18 疾病診斷模型構建 圖19 溯源分析 銳翌合作客戶已發(fā)表16S文章部分展現(xiàn) 下拉查看更多內(nèi)容 [1] Qian Y, Yang X, Xu S, et al. Alteration of the fecal microbiota in Chinese patients with Parkinson’s disease[J]. Brain, Behavior, and Immunity, 2018:S088915911830028X. [IF=6.306]中國帕金森患者的腸道菌群特征 [2] Huang L, Chen Z, Xiong D, et al. Oriented acidification of wasted activated sludge (WAS) focused on odd-carbon volatile fatty acid (VFA): Regulation strategy and microbial community dynamics[J]. Water Research, 2018. [IF=7.051] [3] Wen Q, Ji Y, Hao Y, et al. Effect of sodium chloride on polyhydroxyalkanoate production from food waste fermentation leachate under different organic loading rate[J].Bioresource Technology, 2018, 267: 133-140. [IF=5.807] [4] Xie R, Sun Y, Wu J, et al. Maternal High Fat Diet Alters Gut Microbiota of Offspring and Exacerbates DSS-Induced Colitis in Adulthood[J] .Frontiers in Immunology, 2018, 9: 2608. [IF=5.511]母體高脂飲食改變子代的腸道微生態(tài),，并加重子代成年期對結腸炎的易感性 [5] Shang Q, Wang Y, Pan L, et al. 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Environmental Health Perspectives, 2016, 125(3):437-446. [IF=8.440]生命早期鎘處理對小鼠腸道菌群和脂肪堆積的影響具有性別依賴性 溫 馨 提 示 在《微生物樣本取樣方法和注意事項》中，我們已詳細向您介紹了樣本取樣建議和注意事項,，建議您取樣時采取“少量多管”的方法,。送樣時，請完整填寫紙質(zhì)版《樣品信息單》,！樣品寄送戳這“如何打包寄送測序樣品才安全,？”。 銳翌基因團隊在微生物組實驗設計和測序分析上有雄厚的實力,，可為您提供專業(yè)的科研服務,。您欲開展微生物組研究，可能成為我們的合作伙伴,，我們即可協(xié)助您梳理研究思路和完善實驗方案,，助力您申請國家自然科學基金項目,。期待和您攜手共進！??！ 供稿：盧彥姣 編輯：魯淑妮 |
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