/// 文章簡介
研究背景 可變剪接提供了一種對神經(jīng)元特異基因表達(dá)十分重要的機(jī)制。一些在神經(jīng)元細(xì)胞中廣泛表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白與控制發(fā)育調(diào)控且神經(jīng)元特異的可變剪接程序有關(guān),,單一蛋白能夠調(diào)控許多靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本,。然而,一些RNA結(jié)合蛋白都是在神經(jīng)元集群中選擇性表達(dá),,增加了其可能控制細(xì)胞類型特異和突觸特異的功能的可能性,。KH結(jié)構(gòu)域RNA結(jié)合蛋白SLM2就是這樣一個在小鼠海馬體的谷氨酸能錐體細(xì)胞和一些特定的釋放γ-氨基丁酸(GABA)的中間神經(jīng)元中高表達(dá)的RBP。 研究內(nèi)容 SLM2對小鼠海馬體中的谷氨酸能突觸的功能特性至關(guān)重要,?;蚪M范圍內(nèi)的比對揭示具有明顯選擇性的SLM2依賴的剪接程序主要由少量編碼突觸蛋白的靶標(biāo)mRNA組成。在Slm2敲除的小鼠海馬體中雜合缺失Nrxn1的21號外顯子能夠恢復(fù)突觸表型,,挽回突觸可塑性和行為缺陷,。因此,SLM2對單一可變外顯子的調(diào)控對谷氨酸能突觸的功能和可塑性的規(guī)范及小鼠行為具有重要作用,。 研究方法 首先通過免疫組化和western blot對野生型和Slm2敲除小鼠的海馬體組織進(jìn)行突觸結(jié)構(gòu)和組分分析,,再通過電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測突觸的谷氨酸能傳導(dǎo)和可塑性。通過對兩種小鼠的海馬體組織進(jìn)行RNA-seq獲得了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),,經(jīng)可變剪接分析得到了受SLM2調(diào)控的基因及可變剪接事件,。推測SLM2調(diào)控的Nrxn1的21號外顯子可變剪接與該軸突蛋白和配體的互作有關(guān),并通過免疫共沉淀初步證實(shí)。進(jìn)一步假設(shè)Slm2敲除小鼠中喪失與這些軸突蛋白配體的跨突觸互作,,可能導(dǎo)致突觸后谷氨酸受體缺陷,,通過在Slm2敲除小鼠中雜合去除一個Nrxn1Δex21等位基因,進(jìn)一步證實(shí)該推論,。 研究結(jié)果 (1) Slm2敲除小鼠中的突觸結(jié)構(gòu)和突觸組成,。在Slm2敲除的小鼠中,能在海馬體CA1神經(jīng)元的初級頂樹突上形成正常數(shù)量的谷氨酸能棘突觸(圖1A和B),。WB分析來自野生型和Slm2敲除小鼠海馬體的突觸體組分,,發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出整體正常的谷氨酸能突觸蛋白濃度。然而,,AMPA型谷氨酸受體(AMPAR)亞基GluA1增多,,尤其是在來自成熟的Slm2敲除小鼠突觸體的洗滌劑可溶組分中(圖1和D)。在來自未成年小鼠的急性切片中,,GluA1數(shù)量在全細(xì)胞裂解液和細(xì)胞表面組分中都升高,,而N-甲基-D-天冬氨酸受體GluN1亞基的表達(dá)沒有變化(圖1 E和F)。 圖1. (2) SLM2是正常谷氨酸能傳導(dǎo)和可塑性所必需的,。野生型與Slm2敲除小鼠海馬體的CA1神經(jīng)元切片中微小興奮性突觸后電流(mEPSC)振幅和頻率沒有差別(圖2A和B),,但后者中mEPSC事件的上升速度和衰減時間表現(xiàn)出微小的增加(圖2C和D)。在Slm2敲除的小鼠中,,AMPA受體和NMDA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流比率(AMPAR/NMDAR)顯著升高(圖2E和F),。與野生型相比,在Slm2敲除的CA1神經(jīng)元中,,刺激謝弗側(cè)支引起了更大的突觸后反應(yīng)(圖2G),,而雙脈沖易化正常(圖2H)。證實(shí)Slm2敲除小鼠CA1神經(jīng)元中突觸后AMPA受體表面表達(dá)及功能的提升,。 圖2. (3) SLM2依賴的可變剪接程序的基因組范圍比對,。在全基因組范圍內(nèi)對SLM2依賴的可變剪接事件進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)不同基因型之間轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)高度相關(guān),,表明SLM2不在調(diào)控整體的轉(zhuǎn)錄本水平中發(fā)揮主要功能(圖3A),。野生型和Slm2敲除的小鼠海馬體中絕大多數(shù)外顯子基本保持不變(圖3B),但有四個基因的可變外顯子在敲除小鼠中表現(xiàn)出了不同程度的異常調(diào)控,。編碼突觸細(xì)胞表面受體的三個軸突蛋白基因(Nrxn1,,2和3)的可變剪接片段4(AS4)中的外顯子水平增加了2倍以上,而囊泡融合機(jī)制的一個組分tomosyn-2(Stxbp5l)的24號外顯子水平提高了1.58倍,。另外7個外顯子盡管變化倍數(shù)不高,,仍然表現(xiàn)出顯著變化(P<> 圖3. (4) 在Slm2敲除的海馬體中Nrxn1的21號外顯子雜合缺失恢復(fù)了突觸表型。發(fā)生在Nrxn AS4上的可變剪接,,調(diào)控突觸前末梢軸突蛋白的選擇性跨突觸互作,。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)21個受其調(diào)控的候選互作蛋白,六個顯著差異蛋白中包括神經(jīng)連接蛋白,Chadl,,LRRTMs和補(bǔ)體C3(圖4B),。 假設(shè)Slm2敲除的小鼠海馬體中Nrxn的可變剪接可能會擾亂其與這些剪接插入敏感配體之間的互作。對其進(jìn)行免疫共沉淀分析,,在野生型小鼠的沉淀中發(fā)現(xiàn)大量神經(jīng)連接蛋白1(NL1)和3(NL3),,它們都在Slm2敲除小鼠的沉淀中減少(圖4C),而補(bǔ)體C3的共沉淀則輕微上升,,證實(shí)SLM2的喪失確實(shí)轉(zhuǎn)換了突觸受體-配體互作關(guān)系,。在Slm2敲除小鼠中喪失與這些軸突蛋白配體的跨突觸互作,可能導(dǎo)致突觸后谷氨酸受體缺陷,。為了驗(yàn)證這一假設(shè),,在Slm2敲除小鼠中雜合去除一個Nrxn1Δex21等位基因,恢復(fù)了正常Nrxn1 AS4(-)轉(zhuǎn)錄本水平(圖4D),,從而挽救了內(nèi)源軸突蛋白與NL1和NL3的跨突觸細(xì)胞表面互作(圖4E),,并使急性海馬體切片中GluA1量正常化(圖4F),,部分恢復(fù)了短陣快速脈沖誘導(dǎo)的謝弗側(cè)支LTP(圖4G),,且挽救了小鼠的行為變化(圖4H和I)。因此,,SLM2對單一可變外顯子的調(diào)控對谷氨酸能突觸功能的特化,,可塑性,和小鼠行為具有重要貢獻(xiàn),。 圖4. 與其他RNA結(jié)合蛋白相比,SLM2表現(xiàn)出高度選擇性的神經(jīng)細(xì)胞類型特異的表達(dá),,且僅有一小部分可變的外顯子特異的依賴其功能,。基因拯救實(shí)驗(yàn)證實(shí)單一可變外顯子的恢復(fù)對SLM2敲除小鼠的表型具有重要影響,。猜測這里報道的針對SLM2-軸突蛋白系統(tǒng)的表面受體識別系統(tǒng)的定向,,細(xì)胞類型特異性的剪接調(diào)控,代表了神經(jīng)回路中一種調(diào)控突觸特化的通用機(jī)制,。 Reference Traunmüller, L., A. M. Gomez, T. M. Nguyen and P. Scheiffele (2016). 'Control of neuronal synapse specification by a highly dedicated alternative splicing program.' Science 352(6288). |
|