廣大circRNA研究者同行在針對(duì)感興趣的circRNA進(jìn)行表達(dá)量分析的時(shí)候一定覺(jué)得可選擇的實(shí)驗(yàn)方法比較有限，大規(guī)模篩選一般基于高通量測(cè)序和芯片,，特定circRNA的檢測(cè)基于定量RT-PCR或者微滴式數(shù)字PCR,，偶爾試試Northern Blot。現(xiàn)在有了新的選擇了,，Nature子刊Laboratory Investigation （新開(kāi)的雜志,，還沒(méi)有影響因子，主要發(fā)表一些技術(shù)類(lèi)文章）在線(xiàn)發(fā)布了一項(xiàng)circRNA的定量分析技術(shù)：基于NanoString nCounter 熒光條形碼標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)circRNA絕對(duì)定量分析[1],。

什么是NanoString技術(shù),？原理是什么？

NanoString nCounter 熒光條形碼標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)對(duì)于大部分人可能還是比較陌生的,，這個(gè)技術(shù)是美國(guó)NanoString公司的專(zhuān)利技術(shù),，曾經(jīng)在2008年發(fā)表了Nature Biotechnology文章[2]，感興趣的讀者可以去看看。

NanoString nCounter 熒光條形碼標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)的原理概括起來(lái)就是：針對(duì)靶分子設(shè)計(jì)兩個(gè)探針：捕獲探針和報(bào)告探針,，捕獲探針帶生物素標(biāo)記,，報(bào)告探針帶四色熒光基團(tuán)，可通過(guò)不同的排列組合方式實(shí)現(xiàn)標(biāo)記,。檢測(cè)過(guò)程中將總RNA與兩種探針雜交,，純化，固定后掃描后得到表達(dá)量的結(jié)果,。從測(cè)試的結(jié)果來(lái)看，該技術(shù)的定量效果和檢測(cè)靈敏度要好于傳統(tǒng)的芯片法,，與Real-Time PCR相似,。

圖1  NanoString nCounter技術(shù)原理 （來(lái)自[2]）

NanoString nCounter技術(shù)使用的兩種探針長(zhǎng)度在35-50nt， 設(shè)備經(jīng)條件優(yōu)化后一次性可檢測(cè)800個(gè)分子,。由于必須捕獲探針和報(bào)告探針均能雜交的分子才能被檢測(cè)到,，因此大大提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度，也有一定的檢測(cè)通量,，是核酸分子絕對(duì)定量分析的有益補(bǔ)充,。

怎樣利用NanoString技術(shù)進(jìn)行circRNA的定量？

回到今天給大家介紹的這篇文章,，本文作者選擇B細(xì)胞惡性腫瘤作為實(shí)驗(yàn)材料,，基于RNA-seq結(jié)果針對(duì)52種circRNA設(shè)計(jì)了NanoString nCounter檢測(cè)探針體系（覆蓋了反向拼接位點(diǎn)前后100nt的范圍），嘗試了基于該技術(shù)進(jìn)行circRNA絕對(duì)定量分析,。在高質(zhì)量RNA,，低質(zhì)量RNA中提取的RNA等樣品中對(duì)NanoString nCounter檢測(cè)結(jié)果與RNA-seq和RT-QPCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，表明NanoString nCounter檢測(cè)結(jié)果要比RNA-seq的結(jié)果穩(wěn)定,，可重復(fù)性好,。

首先基于RNA-seq分析了五種B細(xì)胞惡性腫瘤的circRNA表達(dá)情況，挑選了每個(gè)junction point位點(diǎn)Reads數(shù)大于5的列出來(lái)：

圖2  RNA-seq檢測(cè)細(xì)胞中circRNA表達(dá) （來(lái)自[1]）

其中有多種circRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的線(xiàn)性RNA的（circular to linear ratio, CTL ratio）,，具體的也列出了下表：

圖3  CTL較高的circRNA （來(lái)自[1]）

針對(duì)幾個(gè)circRNA也進(jìn)行了RT-PCR和Sanger測(cè)序鑒定,，也做了RNase R消化前后的Northern鑒定：

圖4  相關(guān)circRNA鑒定（來(lái)自[1]）

為驗(yàn)證NanoString nCounter檢測(cè)對(duì)不同質(zhì)量的RNA檢測(cè)的效果，作者除了在培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè),，還選取了冰凍細(xì)胞樣品,，石蠟包埋細(xì)胞樣品，組織樣品等進(jìn)行了驗(yàn)證,，各種RNA樣品的質(zhì)檢結(jié)果：

圖5 各種樣品質(zhì)檢結(jié)果 （來(lái)自[1]）

NanoString nCounter檢測(cè)高質(zhì)量和低質(zhì)量RNA的檢測(cè)結(jié)果分析如下：

圖6  NanoString nCounter檢測(cè)適用于不同RNA質(zhì)量的樣品 （來(lái)自[1]）

RNase R消化后驗(yàn)證檢測(cè)的準(zhǔn)確性,，結(jié)果表明在各種RNA質(zhì)量的樣品中，NanoString nCounter檢測(cè)能準(zhǔn)確的定量circRNA,。

圖7  NanoString nCounter檢測(cè)適用于不同RNA質(zhì)量的樣品 （來(lái)自[1]）

對(duì)NanoString nCounter檢測(cè)的52種circRNA的表達(dá)量結(jié)果做成熱圖如下：

圖8  NanoString nCounter檢測(cè)結(jié)果 （來(lái)自[1]）

本文首次報(bào)道基于NanoString nCounter檢測(cè)對(duì)circRNA進(jìn)行絕對(duì)定量,，該技術(shù)靈敏度較高，穩(wěn)定性好,，而且具有一定的通量,，對(duì)circRNA的檢測(cè)非常有用,。

參考文獻(xiàn)

1. Mette Dahl, I.D., Maria Schertz Andersen, Thomas Birkballe Hansen, Kirsten Gr?nb?k, J?rgen Kjems, Lasse Sommer Kristensen, Enzyme-free digital counting of endogenous circular RNA molecules in B-cell malignancies. Laboratory Investigation, 2018.

2. Geiss, G.K., et al., Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol, 2008. 26(3): p. 317-25.