一,、熒光素酶

熒光素酶（Luciferase）是生物體內(nèi)催化熒光素(Luciferin)或脂肪醛(Firefly Aldehyde)氧化發(fā)光的一類酶的總稱,，來自于自然界能夠發(fā)光的生物。

目前應(yīng)用最為廣泛的是北美螢火蟲熒光素酶和海洋腔腸熒光素酶,。螢火蟲熒光素酶基因可編碼550個氨基酸的熒光素酶蛋白,，是一個61kDa的單體酶，海洋腔腸熒光素酶是一個 36 kDa單亞基蛋白質(zhì),，純化自天然來源的Renillareniformis,。兩者無需表達(dá)后修飾，直接具有完全酶活性,。

Promega公司的Dual-Luciferase試劑盒是目前最常用的雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒,。多用于檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白-核酸互作。NEB公司開發(fā)的專用于細(xì)胞外分泌的熒光素酶檢測系統(tǒng)Gluc和Cluc,。

二,、發(fā)光機(jī)制

螢火蟲熒光素酶在Mg²⁺、ATP,、O₂的參與下,，催化D2熒光素(D2luciferin) 氧化脫羧，產(chǎn)生激活態(tài)的氧化熒光素,，并放出光子,，產(chǎn)生550～580 nm 的熒光。

三,、應(yīng)用范圍

雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)主要用于表觀遺傳以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)中核酸-核酸,、核酸-蛋白之間相互作用的驗(yàn)證。

核酸-核酸：miRNA-mRNA,、lncRNA-miRNA相互作用等,。

核酸-蛋白：轉(zhuǎn)錄因子-啟動子相互作用等。

四,、實(shí)驗(yàn)原理

在熒光素酶報告基因載體的熒光素酶編碼區(qū)的3’UTR插入miRNA靶基因的結(jié)合序列（3’UTR片段）,，然后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并調(diào)控細(xì)胞中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平，通過檢測熒光素酶的表達(dá)情況以分析靶基因是否和miRNA有互作關(guān)系,。

若驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游靶基因作用,，需將預(yù)測的靶基因啟動子替換熒光素酶編碼區(qū)的啟動子，同時轉(zhuǎn)染該轉(zhuǎn)錄因子ORF序列的表達(dá)質(zhì)粒,，檢測熒光強(qiáng)度,，分析轉(zhuǎn)錄因子對對靶基因調(diào)控機(jī)制。

五,、質(zhì)粒選擇

五,、優(yōu)點(diǎn)

1.靈敏度比WB高1000倍以上；

2.內(nèi)源性低,，哺乳動物無內(nèi)源性表達(dá),；

3.熒光信號穩(wěn)定,；

4.檢測手段便捷；

5.檢測范圍廣,，大于7個數(shù)量級,；

六、注意事項(xiàng)

1.根據(jù)研究內(nèi)容的不同來選擇插入位點(diǎn),。轉(zhuǎn)錄因子-啟動子研究時,，插入位點(diǎn)應(yīng)選擇Luc片段之前。miRNA-mRNA研究時,，插入位點(diǎn)應(yīng)選擇在Luc片段之后,。

2.由于酶的反應(yīng)受溫度影響較大，試劑和樣品都應(yīng)達(dá)到室溫在進(jìn)行檢測,。

3.螢火蟲熒光素酶,，統(tǒng)一配制，分裝保存于-70℃,，不能反復(fù)凍融,。

4.海腎熒光素酶現(xiàn)配現(xiàn)用，不能長期保存,。

5.單管測量時每次應(yīng)保持樣品和試劑混勻后1-2s內(nèi)進(jìn)行測量,。

6.吹打混勻過程中盡量不要出現(xiàn)氣泡，影響測量的準(zhǔn)確性,。

7.螢火蟲熒光數(shù)值應(yīng)控制在10⁷數(shù)量級,，海腎熒光數(shù)值應(yīng)控制在不超過10⁸數(shù)量級。如果測量值不符合要求,，可以對轉(zhuǎn)染或檢測體系進(jìn)行調(diào)整,。

赫貝經(jīng)驗(yàn)

1.為了保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)一般需要做3個或3個以上復(fù)孔,。

2.細(xì)胞培養(yǎng)時間不宜過長,，最好控制在12-36h。

3.海腎螢光素酶最好選用pRL-TK等攜帶中等強(qiáng)度啟動子載體,，盡量不使用SV40,、CMV等強(qiáng)啟動子載體,。

4.正式測量前可以先進(jìn)行一次空測（只測底物,，不加樣），作為儀器的背景值,，一般背景值應(yīng)小于100,。

5.測量體系一般選擇20μl細(xì)胞裂解產(chǎn)物，100μl螢火蟲熒光素酶底物,，100μl海腎熒光素酶底物（或10,，50,，50）。測量體系也可據(jù)實(shí)調(diào)整,，但一定要保證底物足量,。