| 血瘀證作為一種基本證候,存在于臨床多種疾病的發(fā)生,、發(fā)展過程中,。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度來看,一些臨床常見的疾病,如高血壓、動脈粥樣硬化,、糖尿病和腫瘤等均存在血小板活化,、血管內(nèi)皮功能障礙、炎癥與氧化應(yīng)激等血瘀相關(guān)現(xiàn)象,。<br> 一氧化氮具有廣泛的生理和病理效應(yīng),。在血管內(nèi)皮細胞和血小板中維持生理濃度的一氧化氮合成有助于調(diào)節(jié)血管張力、抑制血小板活化;超氧陰離子與一氧化氮結(jié)合會降低一氧化氮的生物利用度,促進血小板活化和內(nèi)皮功能障礙;過量表達的一氧化氮主要發(fā)揮細胞毒性和蛋白質(zhì)修飾作用,能引起相關(guān)炎癥通路的活化,進而促進血小板聚集,。因此維系生理濃度一氧化氮的良性調(diào)節(jié)作用,抑制過量一氧化氮對機體的損傷,對維持血管內(nèi)環(huán)境平衡具有非常重要的意義,。<br> 目前阿司匹林仍是國際上最常用的抗血小板藥物。2010年美國心臟病協(xié)會通過循證醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)證明,作用于一氧化氮通路的磷酸二酯酶抑制劑與阿司匹林相比更具優(yōu)勢,對二次中風(fēng)的預(yù)防更安全,、更有效,。<br> 目的:<br> 本研究以阿司匹林為陽性對照藥,對本中心中藥提取物標(biāo)準(zhǔn)庫中具有抗炎或舒張血管作用的38種中藥提取物進行了抗血小板聚集篩選;針對中藥多層次,、多靶點的作用特點,進一步考察了4種有效提取物對血小板活化,、血管舒張、炎癥和抗氧化等方面的作用;最終系統(tǒng)探討了藤梨根提取物對血小板一氧化氮通路相關(guān)靶點的調(diào)節(jié)作用,。<br> 方法：<br> 1.以二磷酸腺苷(ADP),、膠原和花生四烯酸為誘導(dǎo)劑,用Born比濁法檢測38種中藥提取物或單體對大鼠體外血小板聚集的影響。<br> 2.根據(jù)初篩結(jié)果,對部分有效提取物的作用環(huán)節(jié)進行了深入探討:利用微孔板比色法檢測了有效提取物對血小板粘附的影響;通過透射電鏡觀察了血小板超微結(jié)構(gòu)的變化;同時考察了藥物對凝血酶,、血小板活化因子誘導(dǎo)的兔體外血小板聚集的影響,。檢測了不同提取物對內(nèi)皮完整或去除內(nèi)皮后離體血管張力變化的影響,。以LPS和INF-γ聯(lián)合刺激巨噬細胞后引起iNOS活化,產(chǎn)生過量一氧化氮,檢測藥物處理后細胞培養(yǎng)上清液中亞硝酸鹽含量的變化;采用FRAP法檢測了中藥提取物的直接抗氧化能力,。<br> 3.以藤梨根提取物良好的調(diào)節(jié)血管張力和抗血小板聚集作用為基礎(chǔ),通過Westernblot、放射免疫法檢測了蛋白磷酸化和環(huán)核苷酸水平,探討了藤梨根提取物對血小板內(nèi)一氧化氮通路相關(guān)靶點的影響,。<br> 結(jié)果：<br> 1.初篩結(jié)果顯示,16種中藥提取物或單體對ADP、花生四烯酸或膠原誘導(dǎo)的大鼠體外血小板聚集有不同程度的抑制作用,與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05或0.01)。<br> 2.藤梨根提取物(TSRA)可以濃度依賴性抑制凝血酶誘導(dǎo)的兔洗滌血小板聚集(P＜0.05)和血小板粘附;對活化血小板超微結(jié)構(gòu)的影響主要表現(xiàn)為維持細胞膜穩(wěn)定,減少血小板內(nèi)顆粒釋放(P＜0.01);藤梨根提取物對離體主動脈環(huán)具有濃度依賴性舒張作用,該作用可以被L-NAME和ODQ阻斷(P＜0.05或0.01);藤梨根提取物還具有良好的直接抗氧化能力,對巨噬細胞活化后過量NO產(chǎn)生無抑制作用,。<br> 藤梨根的主要化學(xué)成分包括熊果酸,、大黃素和大黃素甲醚等,。本研究檢測了這三種單體成分對血小板聚集,、粘附和超微結(jié)構(gòu)的影響,。結(jié)果顯示,大黃素和大黃素甲醚可顯著抑制ADP誘導(dǎo)的大鼠體外血小板聚集和活化血小板脫顆粒現(xiàn)象(P＜0.05或0.01),大黃素對凝血酶誘導(dǎo)的血小板粘附抑制率達38.54％,對巨噬細胞活化后亞硝酸鹽的產(chǎn)生也有顯著抑制作用(P＜0.05),。熊果酸對血小板聚集無任何抑制作用,。<br> 機制探討:藤梨根提取物對血小板聚集的抑制作用可以被L-NAME阻斷,ODQ僅能減弱而非完全阻斷該作用。低濃度Foskolin與低濃度藤梨根提取物聯(lián)用后能顯著抑制血小板聚集,。血小板的eNOS活性主要由蛋白磷酸化調(diào)節(jié),Western blot結(jié)果顯示藤梨根提取物可以時間依賴性促進eNOS-Ser1177位點的蛋白磷酸化表達,在藥物處理10 min時達到峰值,。eNOS活化后促進NO的生成,藤梨根提取物處理血小板15 min后能在一定程度上促進血小板源NO水平升高,該作用在ADP刺激下或隨著處理時間的延長而顯著增強。藤梨根提取物對凝血酶刺激的血小板內(nèi)cGMP水平有顯著的升高作用,同時不影響cAMP水平,。藤梨根提取物還能促進cGMP下游VASP蛋白磷酸化的表達,。<br> 3.桑枝提取物具有良好的藥理活性,但不同提取部位的作用側(cè)重點不盡相同。桑枝提取物-1(黃酮含量50.24％)和桑枝提取物-2(醇提物經(jīng)正丁醇萃取,過D101大孔樹脂,70％乙醇洗脫部位)對巨噬細胞活化后過量NO的產(chǎn)生具有顯著的抑制作用(P＜0.01),但均不能引起離體主動脈環(huán)舒張或抑制血小板聚集;桑枝提取物-3(主要是生物堿成分)的作用與之相反,對ADP,、花生四烯酸和膠原誘導(dǎo)的大鼠體外血小板聚集(P＜0.05或0.01)有良好的濃度依賴性抑制作用。1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)是桑枝生物堿的主要成分,但實驗結(jié)果顯示,1-DNJ并不具備抗血小板聚集的作用,。<br> 4.苦參素對ADP,、花生四烯酸和血小板活化因子誘導(dǎo)血小板聚集的抑制與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),該作用不能被L-NAME和ODQ阻斷,但苦參素能顯著促進低濃度磷酸二酯酶抑制劑IBMX的抗聚集作用?？鄥⑺鼐S持血小板超微結(jié)構(gòu)穩(wěn)定主要表現(xiàn)為顯著抑制ADP引起的血小板內(nèi)致密顆粒釋放(P＜0.01)和維持細胞膜完整,。<br> 5.芫花提取物能顯著抑制花生四烯酸和凝血酶誘導(dǎo)的大鼠體外血小板聚集(P＜0.05或0.01),該作用不能被L-NAME和ODQ阻斷。芫花提取物對內(nèi)皮完整或去除內(nèi)皮的離體血管環(huán)均有明顯的舒張作用,。<br> 芹菜素是芫花的單體成分之一,。芹菜素能顯著抑制花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集和TXA2生成,對活化巨噬細胞過量NO的產(chǎn)生也有顯著的抑制作用。芹菜素對血小板聚集和巨噬細胞活化的抑制效果與芫花提取物相似,這提示芫花提取物的抗聚集作用可能與抑制花生四烯酸代謝有關(guān),。<br> 結(jié)論：<br> 本文對具有抗炎或擴張血管作用的38個中藥提取物進行抗血小板聚集作用篩選,得到16種有效提取物,其中7種對血小板聚集的抑制作用未見報道;<br> 苦參素,、芫花提取物、桑枝提取物-3(生物堿成分),、藤梨根提取物可以從多途徑抑制血小板活化,同時具有舒張血管或抑制過量NO產(chǎn)生的作用;苦參素與IBMX有協(xié)同增效作用;桑枝提取物-3(生物堿成分)和芫花提取物對血瘀證相關(guān)指標(biāo)的調(diào)節(jié)主要與抑制花生四烯酸代謝通路有關(guān);藤梨根提取物舒張血管和對血小板功能的抑制主要與一氧化氮信息系統(tǒng)有關(guān),。 |
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