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lncRNA功能驗證方法大全

 lwanghonglei 2018-04-06

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,,lncRNAs)是一類長度超過200nt、不編碼蛋白的RNA,,在表觀遺傳及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達,,與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治有密切聯(lián)系,。研究lncRNA想發(fā)高分文章,,運用RNA-seq技術(shù)篩選特異性lncRNA只是第一步,后期實驗驗證才是直接影響文章水平的關(guān)鍵,。小編為大家總結(jié)了lncRNA驗證涉及實驗概念,,趕緊先睹為快~

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1
cDNA末端快速擴增 (Rapid amplification of cDNA ends, RACE) 



目的:確定lncRNA 5’和3’末端序列,進而獲得lncRNA的全長信息,。

原理:在cDNA合成或第二鏈cDNA合成的過程中末端序列外側(cè)引入接頭序列,,通過接頭引物和基因特異性引物進行PCR擴增,,PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測序獲得末端序列信息。



2
RNA免疫沉淀(RNA-Immunoprecipitation, RIP)



目的:IP是研究RNA蛋白相互作用的重要手段,,利用RIP可以研究在體內(nèi)蛋白是否與lncRNA發(fā)生相互作用,。

原理:利用目的蛋白的抗體免疫沉淀蛋白RNA復(fù)合物,從沉淀的RNA蛋白復(fù)合物中純化RNA,,進行定量PCR分析,。



3
熒光素酶報告基因



目的:檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種方法。

原理:熒光素酶可以催化熒光素(luciferin)氧化成oxyluciferin,,在luciferin氧化的過程中,,會發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過熒光測定儀測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光,,進而檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA是否發(fā)生相互作用,。



4
 RNA pulldown



目的:RNA pull-down實驗主要用來鑒定與目的lncRNA結(jié)合的蛋白配體。

原理:蛋白與生物素標記的RNA孵育結(jié)合,,富集的蛋白通過SDS-PAGE分離,,最后選擇特異性蛋白條帶進行質(zhì)譜鑒定。



5
染色質(zhì)免疫共沉淀 (Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)



目的:ChIP主要用于研究lncRNA—蛋白質(zhì)—染色質(zhì)DNA相互作用,,探究 lncRNA對特定染色質(zhì)修飾蛋白或轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用,。

原理:在活細胞狀態(tài)下固定蛋白-DNA復(fù)合物,超聲將DNA隨機打斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,,再通過抗體捕獲蛋白-DNA復(fù)合物,,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。



案例分割線



小編結(jié)合兩篇系統(tǒng)性研究lncRNA的經(jīng)典案例,,從分子機制研究及腫瘤基礎(chǔ)研究兩方面,,與大家聊聊lncRNA測序及后期驗證該怎么做。



1
分子機制研究



lncMyoD通過阻礙IMP2介導(dǎo)的mRNA翻譯調(diào)控骨骼肌分化[1]


期刊:Developmental Cell

IF:9.338


文章簡介



本文應(yīng)用RNA-seq技術(shù),尋找成肌細胞與早期肌管的差異分子,發(fā)現(xiàn)并鑒定出lncMyoD,,并從其對鄰近靶基因MyoD與下游基因調(diào)控方式兩方面探討lncMyoD的調(diào)控機制。


分析思路



1

發(fā)現(xiàn)和鑒定lncMyoD

A. RNA-seq尋找差異分子,;

B. 根據(jù)基因位置關(guān)系確定lncMyoD。




2

lncMyoD序列及表達模式特征

A. RACE確定lncMyoD序列,;

B. lncMyoD表達的時間,、空間及組織特異性分析;

C. lncRNA被定位于細胞核,,在成肌細胞及肌管中特異性表達并具有時間特異性,;

D. lncMyoD編碼蛋白能力生物信息學(xué)預(yù)測及實驗驗證,無蛋白編碼能力,。




3

lncMyoD是MyoD的直接靶標

A.  沉默lncMyoD不影響MyoD基因表達,,而沉默MyoD基因可使lncMyoD表達下調(diào),,從而得出結(jié)論:MyoD在lncMyoD的上游;

B.  通過CHIP和熒光素酶報告基因?qū)嶒?,驗證MyoD可介導(dǎo)lncMyoD的轉(zhuǎn)錄激活,,從而上調(diào)lncMyoD表達。




4
篩選lncMyoD下游調(diào)控靶基因

A. 為尋找lncMyoD調(diào)控的下游靶基因,,通過RNA pulldown檢測到IMP2蛋白;

B.  lncMyoD 表達沉默后IMP2蛋白水平上調(diào),。(研究發(fā)現(xiàn)IMP2蛋白能直接結(jié)合并調(diào)控IMP2 mRNA,,從而增加其自身mRNA的穩(wěn)定性或翻譯。 lncMyoD表達沉默增加了IMP2蛋白和IMP2 mRNA的結(jié)合穩(wěn)定性,,使得IMP2蛋白水平上調(diào),。)

C. lncMyoD負向調(diào)控IMP2介導(dǎo)的增殖基因(N-Ras和c-Myc)的翻譯。(lncMyoD競爭性的結(jié)合IMP2蛋白,,使得IMP2介導(dǎo)的增殖基因(N-Ras和c-Myc)的翻譯受阻,。)




2
腫瘤基礎(chǔ)研究



Lnc-GCASPC作為MiR-17-3P靶標,負向調(diào)控膽囊癌PC蛋白依賴性細胞增殖[2]


期刊:Cancer research

IF:8.556


文章簡介



本研究表明lncRNA-GCASPC在腫瘤組織中表達量下調(diào),,在膽囊癌(GBC)發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,。lncRNA-GCASPC是miR-17-3P的靶標基因,且能夠負向調(diào)控丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,,PC)的表達,,為揭示膽囊癌中l(wèi)ncRNA調(diào)控細胞增殖機制,闡明其致病機制提供新的基礎(chǔ),。




分析思路



1

分子篩選及鑒定

A.  針對5個膽囊癌患者的癌及癌旁組織進行表達譜測序,,分析差異表達的lncRNA及mRNA;

B.  應(yīng)用qRT-PCR在15對癌及癌旁組織樣本中驗證,,篩選出腫瘤組織中顯著下調(diào)且保守的lncRNA-GCASPC(以下簡稱GCASPC),。加大樣本量驗證,證實GCASPC在131個GBC病人組織樣本中顯著下調(diào),,并與病人預(yù)后相關(guān),;

C.  生物信息學(xué)預(yù)測蛋白編碼能力,確定lncRNA-GCASPC無蛋白編碼能力,;

D.  鑒定lncRNA表達特異性,,定位于細胞質(zhì)。




2

細胞及動物實驗的功能驗證

A. 細胞實驗:過表達GCASPC能夠抑制細胞增殖,,敲除GCASPC能促進腫瘤生長,;

B. 動物實驗:GCASPC表達與腫瘤大小相關(guān),且與腫瘤分期,、預(yù)后相關(guān),。其表達量越高,,預(yù)后效果越好。




3

lnc-GCASPC下游靶分子的功能驗證

A. 通過RNA pull-down及質(zhì)譜檢測,,發(fā)現(xiàn)了下游靶分子-丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,,PC)簡稱PC蛋白;

B. 過表達GCASPC,,PC蛋白表達活性下降,、mRNA水平無變化,表明GCASPC可能是通過翻譯或翻譯后調(diào)控PC蛋白的表達活性,。




4

lnc-GCASPC上游分子miR-17-3p研究

A. miRDB預(yù)測到miR-17-3p可與GCASPC配對,,并通過熒光素酶報告基因驗證兩者具有結(jié)合作用;

B. 干擾/過表達miR-17-3p能影響GCASPC的表達,,而干擾/過表達GCASPC不引發(fā)miR-17-3p的表達變化,,驗證GCASPC是miR-17-3p的靶基因;

C. 驗證miR-17-3p的功能,,敲除后可抑制細胞增殖,。




安諾基因

安諾基因lncRNA測序擁有豐富的項目經(jīng)驗,全面的分析內(nèi)容(多組學(xué)聯(lián)合+ceRNA分析),,更綜合下游合作公司資源,,涵蓋 lncRNA篩選、分子生物學(xué)鑒定,、直接靶點篩查,、生物學(xué)功能研究、lncRNA-蛋白-DNA/lncRNA-RNA等多項功能驗證研究,,為您提供全面的一站式服務(wù),!




3
參考文獻


[1]Gong, Chen guang, Li, et al. A Long Non-coding RNA, LncMyoD, Regulates Skeletal Muscle Differentiation by Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation[J]. Developmental Cell, 2015, 34(2):181–191.

[2]Ma M Z, Zhang Y, Weng M Z, et al. Long Non-coding RNA GCASPC, a Target of miR-17-3p, Negatively Regulates Pyruvate Carboxylase-Dependent Cell Proliferation in Gallbladder Cancer[J]. Cancer research, 2016, 76(18).


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