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在代謝組學(xué)研究中,，最常用的樣本前處理方式是有機溶劑沉淀蛋白,，接著使用高速離心或者超濾技術(shù)移除沉淀。使用有機溶劑進行蛋白沉淀,，可以幫助我們同時提取親脂性和親水性化合物,，但是所提取的代謝物的回收率則受提取溶劑或混合提取溶劑的性質(zhì)以及溶劑/樣本比例決定。
根據(jù)能斯特方程可以得出,，如果使用相同溶劑對樣本進行連續(xù)地提取可以提高提取效率,，并且是提取更加完全，但是,，需要注意的是,，用同一種溶劑連續(xù)對樣本進行提取很少在代謝組學(xué)文章中被報道。研究者們喜歡用有機溶劑進行一步提取的原因主要兩個,，第一是縮短前處理時間以達(dá)到高通量分析的目的,；第二個是為了避免過多的提取出不需要的代謝物。例如,，使用甲醇作為提取溶劑對血漿進行一步提取,，血漿中的甘油三酯和膽固醇酯類化合物不會被有效地提取，但是,，這些化合物是可以被儀器檢測到,。既然進行一步提取后的提取液中仍然包含著大量的其他成分（如磷脂類）可能影響質(zhì)譜的分析，還可能降低色譜柱（如氣象色譜柱）的壽命,，所以如果針對某一類成分進行研究,，則需要對提取物進行進一步的純化。
在代謝組學(xué)樣本前處理過程中,，代謝物的損失是不可避免的,，原因包括：與蛋白類大分子共沉淀；代謝物不能溶于提取溶劑或者在提取溶劑中的溶解度很差,；由于代謝物在樣本中的含量太高而引起的溶劑飽和現(xiàn)象,?？偟膩碚f，以上這些影響都是由樣本的基質(zhì)決定的,，這也是為什么在代謝組學(xué)研究中,，針對不同的生物樣本會建立不同的提取方法。
使用有機溶劑進行蛋白沉淀的方法都可以使用蛋白移除率,，代謝物的覆蓋面以及精密度進行評價方法的好壞,。以人的血漿為例，有研究指出使用乙腈或者丙酮可以達(dá)到較好的蛋白移除效果,，但是如果使用甲醇,，甲醇/乙腈，甲醇/乙腈/丙酮混合溶劑,，可以有效地提高代謝物覆蓋面 [1],。對于血清樣本而言，研究指出丙酮和甲醇可以有效地移除大分子蛋白,，如果使用甲醇或者乙腈則可以有效的提取樣本中的極性代謝物 [2],。
對于大樣本量的分析來說，由于需要大量的人工操作,，這種以使用有機溶劑進行蛋白沉淀的步驟可能會降低整個實驗的通量,。因此，近期很多公司都推出了使用96孔板模塊進行自動蛋白沉淀的裝置,，如Captiva（安捷倫）,、HyperSep（賽默飛）、Sirocco（沃特世）,、Impact（Phenomenes）,、Protein Precipitation Filter Plate（Supleco）等。先將生物液體加入96孔板,，然后加入有機溶劑（如甲醇,、乙腈/水、甲醇/水等）進行蛋白沉淀,。接著,，將96孔板加蓋，混勻,，然后將板放入真空裝置過濾沉淀的蛋白,。濾液被收集到一個新的96孔板中，收集好的濾液可以用來直接進行進樣分析,，也可以進行進一步的處理（如揮干溶劑或者凍干）[3-5],。這些96空裝置也可以和多種固相萃取柱相連，用來對提取物進行進一步純化（如去除磷脂類化合物，或者從生物液體中分離特定代謝或者藥物及其代謝物等）,。 另一種可以完成自動蛋白沉淀的技術(shù)是湍流色譜（turbulent flow chromatography，TFC）,。研究者可以使用此項技術(shù)對生物樣本在不經(jīng)過任何前處理的情況下進行分析,，樣本可以直接注入大粒徑填料（25-50μm）填充的色譜柱（如 0.5-1mm × 50mm 內(nèi)徑），使用高流速（1.5-5.0 ml/min）進行洗脫,，在柱子中產(chǎn)生湍流的效果,。在一個很短的洗脫時間內(nèi)（約0.5分鐘），蛋白類物質(zhì)被沖出,，而小分子化合物任然保留在湍流色譜柱中,，之后小分子洗脫液被轉(zhuǎn)移到常規(guī)色譜柱中進行進一步分離分析[6]。對比使用甲醇進行蛋白沉淀和使用湍流色譜進行樣本前處理,，二者的提取物經(jīng)質(zhì)譜檢測后得到的代謝輪廓圖有很大差異,，特別是對脂質(zhì)類物質(zhì)，使用湍流色譜后,，脂質(zhì)類化合物的強度減少了大約10倍 [7],。
參考材料：
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