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單克隆抗體技術(shù)起源于Kohler等創(chuàng)建的體外鼠源雜交瘤技術(shù)。經(jīng)多年研究,，鼠單抗已從單純的生物實(shí)驗(yàn)室科研及臨床診斷發(fā)展到治療性抗體藥物,。但鼠單抗的主要缺陷是小鼠免疫系統(tǒng)不能識(shí)別某些免疫原，尤其是鼠源性的免疫原,，而且鼠單抗的親和性不如兔來源抗體的親和性高,。然而由于沒有發(fā)現(xiàn)兔源性的漿細(xì)胞瘤及病毒體外轉(zhuǎn)染兔B細(xì)胞的技術(shù)困難，直到1995年,，Spieker-Polet等,。
在c-myc/v-abl轉(zhuǎn)基因兔身上成功地獲得了兔漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系,，得到了穩(wěn)定的兔-兔雜交瘤，才使兔單克隆抗體技術(shù)有了突破性進(jìn)展,。
近年兔單克隆抗體技術(shù)日臻完善,，目前商品化的兔單抗已達(dá)數(shù)千種。本文綜述了當(dāng)前兔單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程,、技術(shù)優(yōu)勢(shì)以及兔單克隆抗體技術(shù)在基礎(chǔ)研究,、臨床診斷和治療方面的應(yīng)用前景。 兔的免疫反應(yīng)機(jī)制  兔對(duì)外源蛋白質(zhì)能產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),，在眾多免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中兔多克隆抗體已得到廣泛應(yīng)用,，尤其當(dāng)所涉及的抗原是鼠源蛋白質(zhì)或在鼠體內(nèi)不能引起免疫反應(yīng)時(shí)，兔抗體的作用就顯得愈發(fā)重要了,。上世紀(jì)90年代,，Knight通過轉(zhuǎn)基因手段，開發(fā)了一種新型的兔淋巴瘤細(xì)胞240E-1,，用來制作兔雜交瘤細(xì)胞,，得到兔單克隆抗體。美國(guó)Epitomics公司繼續(xù)改進(jìn)了此項(xiàng)技術(shù),，使之發(fā)展為成熟的兔單抗技術(shù)，并由此開發(fā)了多種高親和力抗體,，廣泛用于基礎(chǔ)研究,、臨床診斷乃至治療性藥物等領(lǐng)域。 與大多數(shù)哺乳動(dòng)物一樣,，兔的免疫反應(yīng)是由一系列復(fù)雜的抗原,、抗原遞程細(xì)胞（antigen presenting cells, APC）、T細(xì)胞以及B細(xì)胞相互作用形成的,。經(jīng)歷初次免疫后,，元B細(xì)胞被刺激分化成分泌抗體的漿細(xì)胞；大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原,，在初次免疫后5天內(nèi)血清中最先出現(xiàn)的特異性抗體多是IgM,；初次免疫反應(yīng)后，在特定細(xì)胞因子以及T細(xì)胞共同作用下,，B細(xì)胞開始分泌IgG,；血清中的抗體滴度2周左右達(dá)到最高，然后緩慢下降,。如果采用多次免疫,，血清中的抗體滴度會(huì)快速上升。兔抗體根據(jù)重鏈的不同可以分為IgG,、IgM,、IgA,、IgE以及IgD 5種類別。兔血清內(nèi)含量最高的抗體是IgG,，濃度5～20 mg/mL,，其次是IgA，濃度3～4 mg/mL,。與小鼠及人類的IgG不同,，兔IgG未發(fā)現(xiàn)亞型，結(jié)構(gòu)也稍有不同,。其在重鏈的N端及D-E環(huán)處的氨基酸數(shù)目比較少,，在重鏈的可變區(qū)還常存在二硫鍵。 兔抗體輕鏈亞型中僅有5 % ～1 0 % 為λ 亞型,，而90%～95%為Cκ1,，且有5種等位基因，分別編碼b4,，b4v, b5,，b6以及b9這5個(gè)抗體輕鏈異型。在Cκ1輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)之間也發(fā)現(xiàn)有二硫鍵的存在,，該二硫鍵可能與兔抗體良好的穩(wěn)定性以及較長(zhǎng)的半衰期有關(guān),。 大多數(shù)哺乳動(dòng)物的抗體形成機(jī)制都是通過抗體基因序列(V, D, J)重排，再經(jīng)過體細(xì)胞突變達(dá)到親和力成熟,。而兔抗體的過程稍有不同,，以重鏈的VDJ基因重排為例，兔抗體的VH基因序列有80%以上相似,，且只有一種VH1亞型,；而JH基因亞型，JH4的使用頻率大約為80%,，另外20%為JH2,，另外3種亞型則很少出現(xiàn)；在12種D基因亞型中,，只有D2a(D9)常見,，其余的亞型非常罕見。這種VDJ重排的局限性造成了兔抗體多樣性有限,，所以兔免疫系統(tǒng)需更頻繁,、更主動(dòng)地進(jìn)行體細(xì)胞基因突變以形成足夠的抗體多樣性。  自從建立了鼠單克隆抗體技術(shù),，人們嘗試過很多用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生兔單抗,，但是由于缺少兔骨髓瘤細(xì)胞系，用異源骨髓瘤融合得到的兔-鼠雜交瘤細(xì)胞有不穩(wěn)定性和不能長(zhǎng)期分泌抗體等問題。 Knight等在一只轉(zhuǎn)基因兔上過量表達(dá)v-abl和c-myc兩種癌基因c,，并分別置于在重鏈和輕鏈的增強(qiáng)子下游,，最終從轉(zhuǎn)基因兔上得到了骨髓瘤樣腫瘤，并從中分離得到了一株骨髓瘤細(xì)胞系,，命名為240E-1,。用這株240E-1細(xì)胞與兔B淋巴細(xì)胞融合得到的雜交瘤能分泌兔單克隆抗體。這是首次通過兔-兔雜交瘤的方式得到兔單克隆抗體,。但與早期鼠骨髓瘤細(xì)胞系一樣,，240E-1細(xì)胞也存在兩個(gè)最主要問題：首先是不穩(wěn)定，經(jīng)過數(shù)次傳代或亞克隆后雜交瘤逐漸失去分泌抗體的能力,；其次,，細(xì)胞株本身會(huì)表達(dá)內(nèi)源性的兔IgG。為了解決穩(wěn)定性問題,，Zhu等[22]改進(jìn)了培養(yǎng)基的方法,，并采用重復(fù)亞克隆技術(shù)，通過11輪亞克隆和篩選,，得到一株新細(xì)胞株,，命名為240E-W。染色體分型實(shí)驗(yàn)證明它的染色體數(shù)目更穩(wěn)定,，有79至90對(duì)（平均84對(duì)）,，與240E-1的44至70對(duì)染色體（平均60對(duì)）相比，240E-W更穩(wěn)定,。DNA指紋圖譜以及基因表達(dá)譜分析也證明這兩株細(xì)胞存在巨大差異,。用240E-W制作融合細(xì)胞株，得到的雜交瘤細(xì)胞融合效率更高也更穩(wěn)定,。為了解決內(nèi)源性IgG的問題，Huang等又從240E-W細(xì)胞的雜交瘤中得到一株不帶有內(nèi)源IgG重鏈基因的細(xì)胞株,，命名為240E-W2,。通過各種大量融合實(shí)驗(yàn)證明，利用240E-W2融合得到的雜交瘤細(xì)胞不會(huì)表達(dá)可檢測(cè)到的內(nèi)源性IgG重鏈,，并提高了融合效率以及雜交瘤陽性率,。  3.1 高親和力 通常用解離系數(shù)(kd)描述抗體和抗原之間的結(jié)合強(qiáng)度，即親和力,。對(duì)于抗體藥物來說,，一般認(rèn)為達(dá)到納摩爾 (nanomolar, 10-9mol/L)級(jí)的解離系數(shù)就有高親和力（對(duì)于大多數(shù)治療用抗體其解離系數(shù)均要求達(dá)到納摩爾或者亞納摩爾級(jí)，kd=10-9 ~10-10 mol/L),。如前所述,，兔單抗的高親和力與其獨(dú)特的免疫親和成熟過程有關(guān)，因此兔單克隆抗體具有相當(dāng)高的親和力，其解離系數(shù)甚至可達(dá)到皮摩爾級(jí) (kd=10-12 mol/L),。這種高親和力使得兔單抗在開發(fā)更靈敏的檢測(cè)試劑以及更有效的藥物方面具有巨大的應(yīng)用潛力,。 3.2 高特異性和低本底 兔單抗具有非常強(qiáng)的結(jié)合特異性。通過蛋白質(zhì)印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)研究大約1000個(gè)不同的兔單抗發(fā)現(xiàn),，大多數(shù)兔單抗能特異性地與目標(biāo)蛋白條帶結(jié)合,。這種高特異性亦已被免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。與小鼠單抗相比,，對(duì)相同的目標(biāo)蛋白,，兔單抗能得到更清晰的免疫組化圖像，并且使石蠟切片上的背景染色大大降低,。Rossi等應(yīng)用兔單抗對(duì)腫瘤和正常組織切片上的雌激素受體,、黃體酮受體、Ki-67,、cyclinD1,、CD3、CD5,、CD23以及synaptophysin等靶標(biāo)進(jìn)行免疫組化染色后,，發(fā)現(xiàn)兔單抗能在不降低特異性的前提下,，提高檢測(cè)的靈敏度,。 3.3 可識(shí)別更多新型表位 人纖維粘連蛋白免疫實(shí)驗(yàn)表明，與小鼠抗體相比,，兔抗體能識(shí)別更多的表位：同時(shí)使數(shù)只小鼠和兔免疫,，一定時(shí)間后取血,，計(jì)算經(jīng)蛋白酶消化后的人纖維粘連蛋白免疫印跡顯示的條帶數(shù)，發(fā)現(xiàn)兔抗體能識(shí)別更多的蛋白條帶,。利用兔特異性抗體會(huì)增加對(duì)于某些特殊抗原表位的識(shí)別能力,，例如磷酸化位點(diǎn)以及其他轉(zhuǎn)譯后修飾的蛋白位點(diǎn)。利用兔單克隆抗體的這一特點(diǎn)可進(jìn)行藥物作用機(jī)理研究,。 3.4 雜交瘤克隆數(shù)更多 在藥物篩選中,，通常需要非常龐大的化合物庫(kù)才能得到足夠的候選藥物，雜交瘤抗體藥物的篩選也是這樣,?？寺‰s交瘤可用小鼠和兔，兔和小鼠相比脾臟更大,，可以融合的B淋巴細(xì)胞數(shù)量是小鼠的近50倍,，因此每一次融合，能得到比小鼠多數(shù)倍的雜交瘤克隆[26],。此外,，研究發(fā)現(xiàn)兔雜交瘤細(xì)胞還較適于高密度培養(yǎng)，細(xì)胞傳代的間隔時(shí)間與小鼠雜交瘤相比可以相應(yīng)縮短。因此可用兔雜交瘤技術(shù)取代鼠雜交瘤技術(shù)來篩選抗體藥物,。 3.5 識(shí)別鼠源蛋白抗體 研究者常使用嚙齒類動(dòng)物作為研究人類疾病的動(dòng)物模型,，并使用這些動(dòng)物模型測(cè)試候選藥物的治療效果。目前科研最常用的動(dòng)物是小鼠和大鼠,。但是,，鼠源抗體作為候選藥物往往不能識(shí)別模型中的鼠源蛋白，要解決這個(gè)問題,，必須從某種異源動(dòng)物得到相應(yīng)“替代抗體”用作動(dòng)物模型的研究,。例如，使用大鼠抗體作為小鼠抗體的“替代抗體”,，反之亦然,。可是“替代抗體”與候選治療性抗體本身往往有很大差別,，親和力不同,，甚至識(shí)別表位也不同。而應(yīng)用兔單抗可解決這一問題,。通過識(shí)別人和鼠源蛋白的共有表位,，兔單抗可同時(shí)結(jié)合人和鼠源蛋白，也省去了制造“替代抗體”的步驟,。 兔單克隆抗體的應(yīng)用 4.1 在生物標(biāo)記物開發(fā)中的應(yīng)用 兔單克隆抗體廣泛用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域[28-31],，尤其在免疫組織化學(xué)以及檢測(cè)蛋白的轉(zhuǎn)譯后修飾方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。至今已有100多種兔單克隆抗體開發(fā)用于癌癥的IHC臨床診斷與研究,，其中最具代表性的就是Her2和c-Kit的IHC診斷試劑盒,。在蛋白修飾研究領(lǐng)域，如蛋白的磷酸化,，在與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)信號(hào)通路中起到了至關(guān)重要的作用,，使用磷酸化蛋白的兔單克隆抗體可以非常清楚地顯示蛋白的磷酸化程度。目前已有200多種磷酸化特異性的兔單克隆抗體面世,。 4.2 在治療抗體藥物開發(fā)中的應(yīng)用 臨床使用的大多數(shù)治療用抗體均需經(jīng)體外親和力成熟這一步驟,，以提高抗體的親和力。這一過程常需8至12個(gè)月,，最終親和力在納摩爾級(jí)(10-9 mol/L)。兔單抗不需使用體外親和力成熟,，就能達(dá)到10-11至10-13 mol/L,。這種高親和力不僅減少抗體的臨床使用量，還能減少由于使用大量抗體帶來的副作用,。但這種高親和力的優(yōu)勢(shì)還需在動(dòng)物和臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí),。另外，與鼠單抗的人源化相比，兔單克隆抗體的人源化更容易,。因?yàn)?，兔單克隆抗體主要由一種重鏈及輕鏈基因構(gòu)成，通過分析大量的兔單克隆抗體序列發(fā)現(xiàn),，兔與人的抗體同源性更高,，約60%～76%，而小鼠與人的抗體同源性略低,，為57%～72%,，說明用兔單克隆抗體開發(fā)藥物前景更廣闊。 結(jié)語 兔單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)為生物醫(yī)學(xué)研究和抗體藥物的發(fā)展提供了大的空間,。由于尋找特異性抗原困難,，技術(shù)上的高壁壘使得單抗治療性藥物在專利保護(hù)到期后也不易被仿制，也不易受通用名藥品價(jià)格的威脅,。進(jìn)一步開發(fā)兔單克隆抗體有望獲得更靈敏,、更可靠的診斷試劑和高質(zhì)量的抗體藥物。 經(jīng)多年研究,，兔單克隆抗體在免疫印跡,、免疫組化、流式細(xì)胞分析及其他免疫學(xué)研究中得到了越來越多的應(yīng)用,。除了首先獲得兔雜交瘤專利的美國(guó)Epitomics公司,，還有其他公司也在開發(fā)自己的兔單克隆抗體產(chǎn)品，如美國(guó)Cell Signaling Technology公司,。由于兔抗體的高親和力,，高特異性并且易于人源化，在治療用抗體以及臨床診斷領(lǐng)域也正逐漸得到重視,。我國(guó)國(guó)內(nèi)有兩家公司均已與美國(guó)公司達(dá)成合作協(xié)議,，將致力于開發(fā)兔單克隆抗體藥物。 |
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