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想必大家都要做實驗課題設(shè)計,，例如在寫開題或者標(biāo)書的時候,，也就是計劃要在接下來要做的實驗，咱們上一期給大家介紹了lncRNA的研究是如何規(guī)劃課題設(shè)計的,，講解了一篇10分文章的lncRNA文章研究套路,。 今天咱們來講一講萬金油miRNA的技術(shù)路線設(shè)計套路，不要只知道熒光素酶報告實驗哦,。
一般來講,，咱們研究miRNA的功能和機制都是關(guān)注其降解調(diào)控靶基因mRNA的豐度水平的，例如miR-X靶向調(diào)控Y基因的mRNA水平,，有哪些技術(shù)路線呢,？ （1）確定配對關(guān)系 最基本的就是調(diào)控關(guān)系是這種堿基配對序列，你在targetscan,、miRanda等網(wǎng)站上預(yù)測的miRNAs多達上百個,，需要進一步驗證他們的匹配性和作用位點。 選打分高的miRNA （2）確定表達負相關(guān)性 那么miRNA和mRNA的表達水平肯定是負相關(guān)的,，就是miRNA↑→mRNA↓,，miRNA↓→mRNA↑，這里需要給一張圖用來證明,。 miRNA和mRNA的關(guān)系是這樣的,。
可以到數(shù)據(jù)庫上去預(yù)測配對關(guān)系、下載,。
或者自己檢測樣本或者細胞中兩者表達情況繪制關(guān)系圖
（3）細胞實驗：miR-X對靶基因呈現(xiàn)梯度抑制現(xiàn)象 體外細胞實驗咱們用到miRNA mimics，這是模擬生物體內(nèi)源的miRNAs,，運用化學(xué)合成的方法合成,，能增強內(nèi)源性miRNA的功能。而miRNA inhibitor是化學(xué)修飾的專門針對細胞中特異的靶miRNA的抑制劑,。
Mimics和miRNA inhibitors示意圖 最經(jīng)典的驗證方式還是檢測時間依賴和濃度依賴,，一般采取濃度依賴檢測就足以,。 設(shè)置了mimics的濃度梯度之后，可以做WB驗證蛋白的表達水平,，也可以直接做Q-PCR驗證mRNA水平,。
這一步的實驗設(shè)計是為了證明miR-X對于Y的上下游調(diào)控關(guān)系以及表達負相關(guān)性，以及確定miRNA mimics的最佳使用濃度,。
（4）miR-X對靶基因mRNA調(diào)控的物理結(jié)合驗證 這一步呢要使用RIP和RNA-pulldown,，但是感覺好貴呢，小小的miRNA實驗都要花這么多錢,，如果有錢呢,，就設(shè)計進去，錢不多就省略掉好了,，反正后面還有其他實驗可以支撐,。
用RISC復(fù)合物的抗體做RIP，以及RNA pulldown,，拿到純化的RNA做個Q-PCR 這樣可以驗證物理上miRNA和mRNA是結(jié)合的,。 但是功能表達互作怎么驗證呢？luciferase reporter assay?。,。?！
（5）miR-X對靶基因mRNA調(diào)控的功能性驗證 這里的就是用熒光素酶報告實驗（luciferase reporter assay） 在熒光素酶報告基因載體的報告基因編碼區(qū)的下游插入ncRNA或者mRNA的3’UTR區(qū),，然后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染細胞并改變細胞中相應(yīng)miRNA的表達水平，通過檢測熒光素酶的表達情況以分析ncRNA或者mRNA的3’UTR區(qū)中是否含有miRNA的靶位點,。同理任意兩種RNA-RNA互作都可以利用這個原理,。 把靶標(biāo)基因的3’ UTR克隆到luciferase載體上，熒光強度與miRNA mimics的濃度成反比
（6）seed region序列的阻斷實驗：anti-miR,、3'UTR突變 前面講的實驗都是基于miRNA和mRNA的互補結(jié)合序列,，那么接下來可以設(shè)計阻斷實驗進行驗證其互作，阻斷實驗有兩種： ①阻斷miRNA的結(jié)合 這里用到miRNA的inhibitors,，例如miR-X的反義RNA寡聚物anti-miR,，其能阻斷miR-X RISC復(fù)合物對靶基因mRNA的降解。
阻斷miR后,，基因的表達不再被抑制 ②突變mRNA的3’ UTR的seed region 就是制作mRNA 3’ UTR的seed region的突變株,，或者構(gòu)建靶基因過表達載體，將3’ UTR的seed region突變,，使得miR-X無法結(jié)合,。
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