DNA雙鏈

當(dāng)使用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因編輯時(shí),，DNA斷裂通常會(huì)相當(dāng)可靠地發(fā)生,，但DNA修復(fù)卻往往并非如此。近日,，美國約翰·霍普金斯大學(xué)Geraldine Seydoux博士課題組通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了基因編輯過程中DNA高效修復(fù)的兩個(gè)必要條件,；線性供體DNA與約35個(gè)核苷酸的短片段長度。

該研究對(duì)應(yīng)論文則發(fā)表于最新上線的PNAS,，名為Precision Genome Editing Using Synthesis-Dependent Repair of Cas9-Induced DNA Breaks,。

Geraldine Seydoux博士及其同事將多種供體DNA的組合插入人類胚胎腎細(xì)胞中并使用供體熒光蛋白編碼DNA對(duì)基因的插入進(jìn)行了驗(yàn)證。

研究人員發(fā)現(xiàn),，在基因編輯的過程中，線性目的DNA片段的編輯效率相對(duì)更好,，質(zhì)粒的編輯效率高出2-5倍,。同時(shí)，文章的作者指出：“通常情況下,，生物實(shí)驗(yàn)室可以通過PCR輕易地制備線性DNA,?！?/p>

與此同時(shí),，研究人員還對(duì)不同長度同源片段的編輯效率進(jìn)行了測定,，他發(fā)現(xiàn)最佳長度的同源臂比那些科學(xué)家通常使用的要短得多,。具體而言,，長度為33至38bp的同源臂在最佳條件下能夠產(chǎn)生10％至20％的成功編輯。相反,，當(dāng)科學(xué)家對(duì)長度為15和16bp的同源臂時(shí)進(jìn)行測試時(shí),，插入的成功率則會(huì)下降一半,。他們在人類基因組的三個(gè)不同位置重復(fù)了這些結(jié)果,。

總體來看,，該基因編輯實(shí)驗(yàn)的總體成功率為10％至50％,，插入長度為57至993bp片段,。在這些基因編輯試驗(yàn)中，較短的序列比較長的序列更易插入,，例如,，57,，714和993bp片段同樣時(shí)間內(nèi)插入的成功率分別為45.4％，23.5％和17.9％,。而當(dāng)片段長度超過1000bp時(shí),，有效編輯則變得很難發(fā)生。

最后,，研究小組還發(fā)現(xiàn),，當(dāng)新序列位于離CRISPR切割位點(diǎn)兩端30個(gè)核苷酸內(nèi)時(shí),，編輯成功率就會(huì)出現(xiàn)峰值,。而當(dāng)新序列位于切割位點(diǎn)30個(gè)核苷酸之外時(shí)，成功的編輯則變得難以發(fā)生。

除了常用的人類胚胎腎細(xì)胞之外,，研究人員還在小鼠胚胎中驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn),。

參考資料：Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks.doi:10.1073/pnas.1711979114.

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