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為了闡明CRISPR是諾獎(jiǎng)級(jí)成果這一問(wèn)題,，筆者在上半篇文章中已經(jīng)對(duì)CRISPR技術(shù)的基本概念和詳細(xì)發(fā)展過(guò)程做出了介紹,，詳見(jiàn)：深度長(zhǎng)文：為什么CRISPR必須拿諾獎(jiǎng)？（上）,。下半篇文章將會(huì)著重介紹CRISPR技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用,，并對(duì)相關(guān)上市公司進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。 IV 植物基因組編輯 2016年初,，杜邦公司宣布要開(kāi)發(fā)一種新型糯玉米的消息并沒(méi)有引起多少人注意,。大家不知道的是，杜邦公司培育糯玉米的技術(shù)「CRISPR」正悄悄改變著整個(gè)育種行業(yè),。該公司運(yùn)用CRISPR技術(shù)敲除了玉米中能夠編碼淀粉合成酶的糯質(zhì)基因wx1,，從而使玉米中直鏈淀粉的含量減少、支鏈淀粉的含量增加,，以此增加玉米的粘性,。
自生命誕生以來(lái)的幾十億年內(nèi)，生命的演化過(guò)程一直遵循著達(dá)爾文的物種演化理論：通過(guò)隨機(jī)遺傳突變獲得生存,、競(jìng)爭(zhēng)和繁衍后代等方面的優(yōu)勢(shì),。但從農(nóng)耕文明開(kāi)始人類就試圖改變外部世界，選擇性的培育更加優(yōu)良的動(dòng)植物,。早期的農(nóng)民通過(guò)隨機(jī)的品種或利用雜交獲得新品種,，但這與自然進(jìn)化過(guò)程類似,，同樣依靠的是DNA的隨機(jī)突變。所以改良過(guò)程十分的緩慢,，雖然經(jīng)過(guò)了數(shù)千年進(jìn)展卻非常的小,。
二十世紀(jì)初孟德?tīng)柕墓ぷ鳛橹参镉N奠定了科學(xué)基礎(chǔ)，并且為育種提供了可預(yù)測(cè)的框架,。二戰(zhàn)之后隨著生物技術(shù)的發(fā)展又出現(xiàn)了新的育種方式,，例如用甲磺酸乙酯、硫酸二甲酯等致突變劑,，或者利用電離輻射或者轉(zhuǎn)座子等手段來(lái)誘導(dǎo)形成DNA突變,，生成新的農(nóng)作物性狀。而現(xiàn)代育種學(xué)則更進(jìn)一步,，可以直接利用分子生物學(xué)手段對(duì)植物的基因組進(jìn)行改造。比如通過(guò)基因重組向植物中引入特定基因形成轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物,。
但基因重組技術(shù)具有自身的局限性,，例如難以準(zhǔn)確定位到基因組，或者進(jìn)行基因的敲除或敲落,。那么如何準(zhǔn)確定位基因組進(jìn)行基因編輯呢,？1996年約翰霍普金斯大學(xué)的Srinivasan Chandrasegaran課題組發(fā)現(xiàn)將具備基因組定位功能的鋅指蛋白 (Zinc finger protein) 和Fokl核酸內(nèi)切酶連接在一起，形成了能夠?qū)NA精切定位和切割的工具,。但該技術(shù)存在很多的問(wèn)題,，其用于基因組定位的鋅指蛋白可編程性較差，設(shè)計(jì)和合成過(guò)程非常漫長(zhǎng),。而且加州的Sangamo公司牢牢地把控著該項(xiàng)技術(shù)的專利,，因此極大的限制了該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。
十幾年之后出現(xiàn)了另一項(xiàng)編程性更強(qiáng)的基因組編輯技術(shù)TALEN,，讓科學(xué)家們能夠快速,、精準(zhǔn)的對(duì)基因組進(jìn)行編輯。TALEN在2011年被Nature Method評(píng)為當(dāng)年的Method of the Year,，然而TALEN僅僅風(fēng)光了一兩年,，就淹沒(méi)在了CRISPR洶涌浪濤之下。 CRISPR被應(yīng)用于玉米育種(painting by Gregory Allen) 由于CRISPR技術(shù)的出現(xiàn),，科學(xué)家能夠以前所未有的精確度來(lái)操控農(nóng)作物的基因組,。其實(shí)CRISPR技術(shù)不只能夠讓育種專家更加便捷的獲得預(yù)期的作物性狀，還能被用于提高多種作物的抗病能力,。CRISPR技術(shù)誕生短短幾年內(nèi)該技術(shù)就被應(yīng)用于編輯小麥基因組,，使其能夠抵抗白葉枯病，使玉米,，大豆,，土豆能夠抵抗除草劑,。2014年，中國(guó)科學(xué)院的科學(xué)家運(yùn)用CRISPR以及TALEN技術(shù)同時(shí)修改小麥Mlo基因的6個(gè)基因拷貝,，使其能夠抵抗白粉病,。越來(lái)越多的作物正收益與CRISPR技術(shù)，使其具有更頑強(qiáng)的生命力,。
與此同時(shí),，CRISPR對(duì)植物生物學(xué)研究的推進(jìn)作用也是巨大的。長(zhǎng)久以來(lái)科學(xué)家一直通過(guò)觀察自然界存在的天然突變,，或者通過(guò)人工誘導(dǎo)隨機(jī)突變來(lái)探究作物中基因的功能,。而CRISPR卻能夠以更加快速，更加高效的方式在基因中引入突變,，破壞基因的編碼區(qū),，誘導(dǎo)其產(chǎn)生功能異常的蛋白，以此探究基因的功能,。除此之外,，CRISPR還可用于靶向miRNA來(lái)激活或抑制特定植物基因的表達(dá)，或是基因的敲入,、替換,，甚至運(yùn)用dCas9來(lái)調(diào)控植物基因轉(zhuǎn)錄等等。 V 動(dòng)物基因組編輯
除了糧食作物,，CRISPR技術(shù)也能夠?qū)π竽翗I(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響,，通過(guò)很小的基因組修飾會(huì)很大程度地提高養(yǎng)殖動(dòng)物肉產(chǎn)量。而且與農(nóng)作物中的應(yīng)用類似,，運(yùn)用CRISPR技術(shù)可以很方便的同時(shí)修改動(dòng)物多個(gè)基因,，比如中國(guó)的科學(xué)家利用CRISPR同時(shí)修改肌肉生成抑制素基因MSTN和能夠控制毛發(fā)生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子基因FGF5，同時(shí)提高了山羊的肉產(chǎn)量和毛發(fā)質(zhì)量,。
雖然CRISPR編輯的動(dòng)物能夠推動(dòng)畜牧業(yè)的發(fā)展,，但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究領(lǐng)域卻能最好的體現(xiàn)CRISPR技術(shù)的無(wú)限潛力。無(wú)論是用于病理研究還是新藥評(píng)價(jià),，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都對(duì)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有著極其重要的意義,。而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究最基礎(chǔ)，最重要的是獲得可靠的動(dòng)物模型,，以此才能模擬人類發(fā)病的外在表現(xiàn)形式和內(nèi)在發(fā)病機(jī)制,。
從上世紀(jì)初開(kāi)始，小鼠就已成為生物醫(yī)學(xué)研究中最常用的哺乳動(dòng)物模型,，現(xiàn)今已有超過(guò)三萬(wàn)種小鼠品系,，用于從癌癥到心血管疾病、失明等一系列疾病的研究,。CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)為小鼠模型的建立提供了高效,，快速的技術(shù)手段,。不僅適用于幾乎所有的小鼠品系，還能夠極大地縮短所需的時(shí)間,，同時(shí)其成本也相對(duì)低廉,，其成本僅為傳統(tǒng)基因工具的十分之一左右。
雖然小鼠動(dòng)物模型的應(yīng)用廣泛,，但其仍具有一系列局限性,。對(duì)于諸如囊性纖維化、帕金森,、阿爾茨海默病等疾病,，它們通常無(wú)法表現(xiàn)出疾病的特征性癥狀，藥效評(píng)價(jià)中也可能出現(xiàn)非典型反應(yīng),。這就讓實(shí)驗(yàn)室研究向臨床試驗(yàn)研究轉(zhuǎn)化變得異常艱難,。CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)使非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的建立變得更加高效。
雖然十幾年前就可以通過(guò)病毒將外源基因轉(zhuǎn)入猴子基因組內(nèi),，但CRISPR技術(shù)出現(xiàn)以前科學(xué)家卻無(wú)法對(duì)猴子基因組進(jìn)行編輯,。在2014年初，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所的黃行許將CRISPR注入單細(xì)胞胚胎,，通過(guò)引入Ppar-γ和 Rag1 組合突變對(duì)食蟹猴的基因組進(jìn)行精確的修飾,，以此獲得了世界首只基因敲除猴,。 CRISPR-Cas9 Horse Baby,；by MichaelCammer 除了老鼠與猴，由于CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)豬也開(kāi)始成為一種比較重要的動(dòng)物模型,。豬的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)與人有類似之處,，器官大小與人類的相似，而且繁殖周期短,、產(chǎn)仔數(shù)量多,，所以也可以作為動(dòng)物模型，但更加重要的是豬器官可能成為人類器官移植手術(shù)的重要來(lái)源,。其實(shí)長(zhǎng)久以來(lái)這一直是一些科學(xué)家的夢(mèng)想,，但由于技術(shù)的限制使它遙不可及。即使是人類之間的器官移植也可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng),，何況是異種之間移植,。而且豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(PERVs)的存在也是個(gè)很大的安全隱患。
CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)使我們向豬器官成為人類器官移植來(lái)源的追尋之路邁進(jìn)了一大步,。之前的技術(shù)主要是通過(guò)向豬基因組轉(zhuǎn)移人的某些基因來(lái)逃避免疫排斥過(guò)激反應(yīng),，但包括CRISPR在內(nèi)的基因編輯技術(shù)能夠直接敲除引起免疫反應(yīng)的基因，或者直接敲除PERVs基因,。
2015年哈佛大學(xué)的GeorgeChurch和他的學(xué)生楊璐菡共同成立的eGenesis,，希望運(yùn)用CRISPR技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)豬人體器官移植的宏偉目標(biāo),。同年他們便實(shí)現(xiàn)了運(yùn)用CRISPR同時(shí)敲除豬基因組內(nèi)PERVs基因的62個(gè)位點(diǎn)這一壯舉。之后他們又完成了另一項(xiàng)成就：獲得不含PERVs基因的小豬,。他們首先在不觸發(fā)細(xì)胞凋亡的前提下大范圍敲出豬胚胎結(jié)締組織細(xì)胞基因組的PERVs基因,，之后采用克隆技術(shù)將細(xì)胞核轉(zhuǎn)入豬卵細(xì)胞，發(fā)育形成胚胎之后移植入豬子宮內(nèi)并成功產(chǎn)下豬仔,。
雖然豬器官的應(yīng)用未來(lái)還有很漫長(zhǎng)的路要走,，但CRISPR的無(wú)限潛力使我們更改更早的看到這一天的到來(lái)。因楊璐菡對(duì)醫(yī)療領(lǐng)域的貢獻(xiàn),，她入選了世界經(jīng)濟(jì)論壇評(píng)出的2017年度“全球青年領(lǐng)袖,。
除了醫(yī)療領(lǐng)域相關(guān)的應(yīng)用，腦洞極大的GeorgeChurch也在進(jìn)行一項(xiàng)知名度相當(dāng)高的項(xiàng)目：復(fù)活猛犸象,。兩頭在大約兩萬(wàn)年至六萬(wàn)年前死亡的兩頭猛犸象標(biāo)本為其全基因組測(cè)序提供了可能,。通過(guò)基因組分析可以得到猛犸象與現(xiàn)存的象的基因組變化，并發(fā)現(xiàn)了能夠編輯與體溫感知,、皮膚和毛發(fā)發(fā)育,，脂肪組織生成等過(guò)程相關(guān)的蛋白的1668個(gè)基因差異。George組在2015年運(yùn)用CRISPR技術(shù)成功將現(xiàn)代象的其中14個(gè)基因替換為猛犸象的基因,，但替換所有基因無(wú)疑會(huì)使一項(xiàng)非常浩大的工程,，而且修改完之后的大象細(xì)胞并不一定能夠克隆并發(fā)育成為胚胎。(GeorgeChurch前幾年出版了一本書(shū)詳細(xì)解釋了他的這一宏偉目標(biāo),，此書(shū)腦洞極大,，還包括如何合成人的“手性異構(gòu)體’’等研究項(xiàng)目)。 復(fù)活猛犸象 By NBC 除了以上這些應(yīng)用,，科學(xué)家們也在利用CRISPR技術(shù)控制遺傳過(guò)程,，修改子代的遺傳信息。這項(xiàng)技術(shù)被稱為Genedrive,。在二倍體生物的有性繁殖過(guò)程中,，后代從父母兩方分別獲得一組染色體拷貝，這也就意味著親代的基因 (selfish gene 除外) 有50%的可能性遺傳給后代,。但運(yùn)用Genedrive技術(shù)可以使遺傳信息傳遞方式改變,。
主導(dǎo)這個(gè)項(xiàng)目的是GeorgeChurch (又是他) 組的Kevin Esvelt。這項(xiàng)技術(shù)的核心是基因的敲入,，利用CRISPR技術(shù)對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行精確剪切并插入一段新的序列,。而插入的該序列包含生成CRISPR基因編輯系統(tǒng)的的信息，所以它能夠自動(dòng)的將自身拷貝到另一條染色體上,，使子代的所有個(gè)體的染色體上都包含能夠編碼CRISPR系統(tǒng)的信息,。
如果插入的序列不僅包含CRISPR信息，還包含其他信息，那么該信息也能夠在子代快速擴(kuò)散,。比如利用Genedrive在蚊子基因組插入瘧原蟲(chóng)抗性基因,，理論上在一段時(shí)間后該區(qū)域內(nèi)的所有蚊子將會(huì)全部攜帶瘧原蟲(chóng)抗性基因。這會(huì)成為瘧疾疾病預(yù)防的重大進(jìn)展,。但很多科學(xué)家并沒(méi)有止步于此,，他們?cè)O(shè)想的是在蚊子基因組插入雌性不育相關(guān)基因，使該基因在某些蚊子種群中像病毒一般快速傳播,，導(dǎo)致該蚊子種群在此區(qū)域內(nèi)快速滅絕,。
這會(huì)是一項(xiàng)非常可怕的技術(shù),，在實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)過(guò)程科學(xué)家也應(yīng)該盡全力避免基因修飾過(guò)的蚊子擴(kuò)散到外界,。在釋放的過(guò)程中很難預(yù)料影響會(huì)擴(kuò)散到多大的區(qū)域內(nèi)，而且如果使某些區(qū)域內(nèi)的蚊子快速滅絕,，盡管有些科學(xué)家聲稱不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響,，但個(gè)人覺(jué)得對(duì)生態(tài)的影響會(huì)很難預(yù)料，生態(tài)系統(tǒng)不會(huì)像一些模型預(yù)測(cè)的那么簡(jiǎn)單,。
除此之外,，最重要的問(wèn)題是如何預(yù)防該技術(shù)的惡意使用？Genedrive的設(shè)計(jì)并不十分困難,，如果有人向蚊子的基因組中插入某些惡性基因,，那么該技術(shù)會(huì)立即變成Gene Bomb (基因炸彈)。如何安全的使用該技術(shù)將會(huì)是一個(gè)非常大的問(wèn)題,。 VI 疾病治療
多種動(dòng)物模型的臨床前實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明了CRISPR在臨床前動(dòng)物模型中的巨大潛力,，也為疾病研究和藥物研發(fā)提供了重要的工具。但CRISPR技術(shù)能不能更加直接的被用來(lái)治療疾病呢,？
2013年張鋒和GeorgeChurch實(shí)驗(yàn)室證明CRISPR編輯人類細(xì)胞的可行性之后不到一年的時(shí)間,，中科院上海生化與細(xì)胞生物學(xué)研究所的李勁松課題組就使用相同的基因編輯工具驗(yàn)證其治療遺傳病的潛力,。他們選擇了小鼠白內(nèi)障遺傳疾病模型進(jìn)行研究,，試驗(yàn)中的模型小鼠攜帶顯性突變的Crygc基因能夠產(chǎn)生變性的晶狀體蛋白而發(fā)生混濁導(dǎo)致白內(nèi)障。結(jié)果CRISPR能從小鼠基因組的大約28億個(gè)堿基對(duì)中找到并修復(fù)突變,。
研究人員設(shè)計(jì)了針對(duì)突變Crygc基因的導(dǎo)向RNA并直接將導(dǎo)向RNA和Cas9注入雜合子的受精卵中,，之后發(fā)現(xiàn)有1/3的新生小鼠白內(nèi)障癥狀被治愈。而且治愈的小鼠可以通過(guò)生殖細(xì)胞將CRISPR-Cas9系統(tǒng)修復(fù)的Crygc基因傳遞到下一代,。之后幾年科學(xué)家又用CRISPR治愈了小鼠的肌萎縮以及肝臟代謝相關(guān)疾病,，并證明了該技術(shù)治療鐮狀細(xì)胞貧血癥，血友病,，囊性纖維化,，重癥聯(lián)合免疫缺陷等重大疾病的潛力。無(wú)論是核苷酸突變,、缺失/增加,，甚至是染色體異常CRISPR似乎都能勝任,。
以上這些研究都為CRISPR技術(shù)直接應(yīng)用于人類遺傳病治療提供了安全性和有效性的初步驗(yàn)證。當(dāng)然CRISPR的潛力遠(yuǎn)不止用于治療遺傳病,，科學(xué)家們還在嘗試用基因編輯來(lái)阻止人體細(xì)胞免遭病毒感染,，實(shí)際上在此之前第一個(gè)基因編輯臨床試驗(yàn)正是為了治療HIV感染。除了傳染病領(lǐng)域,，癌癥也是CRISPR技術(shù)應(yīng)用的領(lǐng)域之一,。 基因編輯 By Gloria Pizzilli 雖然基因編輯是一個(gè)非常強(qiáng)大的工具，但將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的成果轉(zhuǎn)化為臨床研究的勝利并不容易,。過(guò)去幾十年基因治療所面臨的風(fēng)風(fēng)雨雨提醒我們醫(yī)學(xué)的進(jìn)展遠(yuǎn)比我們想象的艱難,。科學(xué)家面臨的第一個(gè)問(wèn)題是靶細(xì)胞的選擇,，體細(xì)胞還是胚胎細(xì)胞,？
通過(guò)修改單細(xì)胞胚胎，其發(fā)育之后所有細(xì)胞的基因組將會(huì)被改變,，其后代所遺傳的基因組也將會(huì)被改變,，動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)也證明了該策略的可行性。但該方法面臨著這嚴(yán)重的倫理問(wèn)題,。于是體細(xì)胞就成了大多數(shù)科學(xué)家的第一選擇,。體細(xì)胞的基因組修飾無(wú)法遺傳給后代從而減少了倫理問(wèn)題，但體細(xì)胞的基因組編輯遠(yuǎn)比生殖細(xì)胞論復(fù)雜的多,，因此我們必須解決選擇體細(xì)胞做基因組編輯所帶來(lái)的新問(wèn)題,。
其中最大的問(wèn)題是藥物的遞送問(wèn)題。不同的疾病會(huì)影響不同的人體部位,，比如亨廷頓氏舞蹈病主要影響腦內(nèi)神經(jīng)元,，而鐮刀狀細(xì)胞貧血癥則影響紅細(xì)胞，囊性纖維化則主要影響肺部,。選擇可及性比較高的體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)則是相對(duì)容易的方向,。而循環(huán)系統(tǒng)的治療方式也有兩類：體內(nèi)基因編輯(in vivo) 和體外基因編輯 (ex vivo)。相對(duì)而言,，體外的基因編輯方式更加簡(jiǎn)便,，而且有利于質(zhì)量控制。去年四川大學(xué)華西醫(yī)院的盧鈾團(tuán)隊(duì)率先開(kāi)展了世界首個(gè)CRISPR人體臨床試驗(yàn),，敲除T細(xì)胞表面的明星分子PD-1,。該團(tuán)隊(duì)所采用的正是體外基因編輯的方式。
但并不是所有科學(xué)家的思路都與以上的方式相同,，首先選擇采用體細(xì)胞的基因編輯,。
2015年3月，5位學(xué)者在Nature聯(lián)名發(fā)表文章Don’t edit the human germ line (不要編輯人類生殖細(xì)胞，聽(tīng)起來(lái)有點(diǎn)像三體監(jiān)聽(tīng)員回復(fù)葉文潔的三句不要回答),，呼吁科研工作者謹(jǐn)慎使用基因編輯工具編輯生殖細(xì)胞基因組,。但僅一個(gè)月后，中山大學(xué)的黃軍就組的文章上線,，報(bào)道了使用CRISPR技術(shù)編輯86個(gè)無(wú)活性人類胚胎,，以期修改能夠?qū)е碌刂泻Ｘ氀腍BB基因。雖然實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不理想,，但由于倫理問(wèn)題該文章在國(guó)際上引起了巨大爭(zhēng)議,。很多人擔(dān)心如果CRISPR被用于修改人類胚胎基因組來(lái)預(yù)防遺傳病，那么該技術(shù)將難以避免的被應(yīng)用于修改非醫(yī)學(xué)相關(guān)的基因問(wèn)題,。盡管如此,，黃軍就還是被Nature雜志評(píng)選為當(dāng)年的年度十大科學(xué)人物。 編輯人胚胎：誰(shuí)在扮演上帝的角色,？(創(chuàng)世紀(jì)壁畫(huà) by 米開(kāi)朗基羅) 由于該文章所引發(fā)的巨大爭(zhēng)議,，同年美國(guó)、英國(guó)和中國(guó)在華盛頓聯(lián)合組織了人類基因組編輯國(guó)際峰會(huì),，對(duì)人類基因組編輯的安全問(wèn)題,、倫理問(wèn)題和政府監(jiān)管進(jìn)行了討論。在這之后,，胚胎基因編輯的倫理爭(zhēng)議似乎開(kāi)始變得沒(méi)那么激烈,，2016年瑞典和英國(guó)成為了中國(guó)之外的，允許胚胎進(jìn)行基因編輯的另外兩個(gè)國(guó)家,。
由于技術(shù)越來(lái)越成熟,，該領(lǐng)域的研究和文章也越來(lái)越多。截止目前共有8篇人類胚胎編輯的文章發(fā)表,，而其中5篇是在過(guò)去兩個(gè)月內(nèi)發(fā)表的,。兩周前(9月22日) 黃軍就的另一篇文章上線，同樣是修飾HBB基因用于治療地中海貧血,，但這一次使用的是克隆胚胎細(xì)胞,，而且利用的是不具有剪切功能的CRISPR系統(tǒng) (且攜帶胞苷脫氨酶)進(jìn)行堿基編輯，以修飾點(diǎn)突變,。
毫無(wú)疑問(wèn)運(yùn)用CRISPR進(jìn)行人胚胎基因組編輯能夠?qū)θ祟惣膊〉念A(yù)防產(chǎn)生巨大的影響,，雖然現(xiàn)在的研究重點(diǎn)主要集中于體細(xì)胞基因組編輯,，用以治療疾病,，但隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，CRISPR編輯生殖細(xì)胞的潛力會(huì)被進(jìn)一步挖掘,，倫理問(wèn)題也可能因此得到比較好的解決,。 VII CRISPR相關(guān)生物技術(shù)公司
嗜熱鏈球菌能夠?qū)⑷樘寝D(zhuǎn)化為乳酸，所以常用于奶制品行業(yè)。丹麥的Danisco公司首先證明了嗜熱鏈球菌含有的CRISPR序列的功能是細(xì)菌的適應(yīng)性免疫,，用以抵御噬菌體入侵（見(jiàn)：深度長(zhǎng)文：為什么CRISPR必須拿諾獎(jiǎng),？（上））。2011年杜邦公司收購(gòu)了Danisco,，并開(kāi)始研究如何利用CRISPR抵抗噬菌體感染的嗜熱鏈球菌,，更好的制造酸奶和奶酪。同年,，Jennifer Doudna還在研究第一類CRISPR系統(tǒng)的時(shí)候,，她就參與創(chuàng)立了Caribou Biosciences，希望運(yùn)用CRISPR技術(shù)來(lái)簡(jiǎn)化病毒檢測(cè)的過(guò)程,。 Emmanuelle Charpentier在2012年也逐漸有了創(chuàng)立公司的想法,。在Science文章上線的五個(gè)月后，她便與當(dāng)時(shí)還在賽諾菲任高管的老友Rodger Novak以及另一位風(fēng)險(xiǎn)投資家的老友Shaun Foy討論CRISPR的商業(yè)潛力,。一個(gè)月后Novak決定辭職共同創(chuàng)立一家新公司,。之后三人開(kāi)始積極尋找合作伙伴。 在與Jennifer交流之后他們計(jì)劃聯(lián)合George Church和張鋒共同創(chuàng)立這家公司,，以期簡(jiǎn)化之后可能存在的專利問(wèn)題,。但不幸的是，由于各種已知和未知的原因之后的商談極其不順利,。在張鋒和Church文章發(fā)表的一年半以后,，CRISPR技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越成熟，資本強(qiáng)烈期望介入,，成立公司的需求也越來(lái)越迫切,。 CRISPR專利聽(tīng)證會(huì)；來(lái)源： Science 但在知識(shí)產(chǎn)權(quán),、學(xué)術(shù)信譽(yù),、地理因素、媒體報(bào)道,、諾貝爾獎(jiǎng),、商業(yè)回報(bào)等一系列因素的考量下，對(duì)CRISPR技術(shù)做出巨大貢獻(xiàn)的四個(gè)人不僅沒(méi)有團(tuán)結(jié)一致,，反而開(kāi)始分崩離析,、各自為政。Jennifer和Emma二人組的關(guān)系也不像從前那么單純,，變得越來(lái)越微妙,。不僅個(gè)人的利益摻雜其中，加州大學(xué),、布羅德研究所,、哈佛大學(xué),、麻省理工、維也納大學(xué)這幾個(gè)學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)的利益之爭(zhēng)也讓局面越來(lái)越復(fù)雜,。 在此之后,，Emmanuelle Charpentier, Rodger Novak, Shaun Foy, 以及Chad Cowan共同成立了CRISPR Therapeutics。張鋒,，George Church, Jennifer Doudna共同成立了Editas Medicine,。Erik Sontheimer, Luciano Marraffini, Derrick Rossi和 Rodolphe Barrangou共同成立了Intellia Therapeutics。而之后入局的其他公司則需要向以上這幾家公司和布羅德研究所支付高昂的專利授權(quán)費(fèi),。
在2014年關(guān)鍵專利授權(quán)給張鋒之后一個(gè)月,，Jennifer離開(kāi)了Editas，加入Intellia,。 VIII 寫(xiě)在最后
我想現(xiàn)在已經(jīng)很難找到一個(gè)沒(méi)有聽(tīng)說(shuō)過(guò)CRISPR這個(gè)名詞的生物專業(yè)學(xué)生,。短短幾年內(nèi)CRISPR技術(shù)已經(jīng)為基礎(chǔ)科研領(lǐng)域，和包括醫(yī)療健康以及農(nóng)業(yè)等與大眾生活更相關(guān)的領(lǐng)域的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用,。在科學(xué)的發(fā)展過(guò)程中,，偶爾會(huì)有重大的進(jìn)展出現(xiàn)，比如相對(duì)論,，比如DNA雙螺旋,，比如PCR技術(shù)，CRISPR雖然可能不能與以上的突破比肩,，但其對(duì)科學(xué)發(fā)展的影響是毋庸置疑的,。
Jennifer和Emma的工作為CRISPR作為基因編輯工具的誕生提供了基礎(chǔ)，而張鋒和Church兩人同時(shí)證明了CRISPR編輯哺乳動(dòng)物細(xì)胞的巨大潛力,。毫無(wú)疑問(wèn),，這些人對(duì)于CRISPR技術(shù)的誕生與發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。但如果沒(méi)有Jennifer,，如果沒(méi)有Emma,，或者沒(méi)有Church，沒(méi)有張鋒,，CRISPR技術(shù)就不會(huì)出現(xiàn)了嗎,？顯然不是(參見(jiàn)附錄的時(shí)間線)。
CRISPR能拿諾獎(jiǎng)的實(shí)力爭(zhēng)議很小,，但誰(shuí)最后能夠拿到諾獎(jiǎng)卻是個(gè)很大的謎團(tuán),。科學(xué)界并不像人們想象的那樣單純,，在利益和榮譽(yù)面前多數(shù)會(huì)變的不理性,。在關(guān)于CRISPR的戰(zhàn)爭(zhēng)中，有人獲得了金錢,，有人獲得了榮耀,，有人開(kāi)心,，但也有人失落,。
如果說(shuō)CRISPR技術(shù)推動(dòng)了科學(xué)的進(jìn)展,，使我們更加憧憬未來(lái)的美好生活，那么關(guān)于CRISPR技術(shù)的利益之戰(zhàn)和榮譽(yù)之爭(zhēng),，卻更讓我們理解了人的本性,。 CRISPR Me by Michele Tragakiss 附錄：CRISPR時(shí)間線
CRISPR的發(fā)現(xiàn)與其功能
Cas9與PAM的發(fā)現(xiàn) 2005年5月,，法國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)研究院（INRA）Alexander Bolotin, 在研究嗜熱鏈球菌的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與眾不同的CRISPR位點(diǎn)(Bolotin et al., 2005)，該CRISPR系統(tǒng)缺乏之前熟知的cas蛋白基因,，而還有其他未報(bào)到過(guò)的新cas蛋白基因,，其中之一正是編碼后來(lái)被命名為Cas9蛋白的cas基因。而且他發(fā)現(xiàn),，與病毒DNA匹配的間隔序列一端均含有一個(gè)相同序列PAM(protospacer adjacent motif),，PAM是CRISPR目標(biāo)序列識(shí)別所必須的。
適應(yīng)性免疫假說(shuō) 2006年3月,，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心Eugene Koonin通過(guò)計(jì)算分析直系同源蛋白,，并提出了CRISPR級(jí)聯(lián)為基于插入噬菌體同源DNA到間隔序列的細(xì)菌免疫系統(tǒng)的假設(shè)，摒棄了之前關(guān)于Cas蛋白作為DNA修復(fù)系統(tǒng)的假設(shè)(Makarovaet al., 2006),。
適應(yīng)性免疫功能的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 2007年3月,，Danisco公司Philippe Horvath試圖研究廣泛應(yīng)用于奶制品工業(yè)的嗜熱鏈球菌對(duì)于噬菌體的反應(yīng)。Horvath及其同事通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)確實(shí)屬于適應(yīng)性免疫：將新的噬菌體DNA片段整合入CRISPR,，并用以抵抗該類噬菌體的下一次攻擊(Barrangou et al., 2007),。他們還發(fā)現(xiàn)Cas9可能是使入侵噬菌體失活過(guò)程中唯一必須的蛋白。
間隔序列被轉(zhuǎn)錄為向?qū)NA 2008年8月,，荷蘭瓦赫寧根大學(xué)John van der Oost開(kāi)始逐漸解析出CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾噬菌體入侵的過(guò)程,。Johnvan der Oost 及其同事發(fā)現(xiàn)來(lái)源于噬菌體的間隔序列能夠轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)小RNA，成為CRISPR RNAs (crRNAs),，能夠引導(dǎo)Cas蛋白靶向目標(biāo)基因(Brouns et al., 2008),。
CRISPR如何作用于DNA靶標(biāo) 2008年12月,，美國(guó)西北大學(xué)Luciano Marraffini 和 Erik Sontheimer發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)作用的靶標(biāo)是DNA而非RNA (Marraffini and Sontheimer, 2008)。由于人們一直以來(lái)都認(rèn)為CRISPR和RNAi具有類似的機(jī)制,，這一發(fā)現(xiàn)讓研究人員感到意外,。Marraffini和 Sontheimer 表示該系統(tǒng)如果能夠轉(zhuǎn)移到非細(xì)菌系統(tǒng)中，將可能開(kāi)發(fā)成為強(qiáng)大的工具 (需要注意的是有的CRISPR系統(tǒng)可以靶向RNA (Hale etal., 2009),。
Cas9 剪切目標(biāo)DNA 2010年12月,，加拿大拉瓦爾大學(xué)Sylvain Moineau及其同事發(fā)現(xiàn)可以靶向DNA并在精確位點(diǎn)（PAM上游三個(gè)核苷酸）引起雙鏈斷裂(Garneau et al., 2010)。他們同時(shí)確證Cas9是CRISPR-Cas9體系剪切過(guò)程所需的唯一蛋白,、由單個(gè)蛋白（此處為Cas9蛋白）和crRNAs介導(dǎo)的干擾過(guò)程是第二類CRISPR系統(tǒng)的獨(dú)有特征,。
Cas9 系統(tǒng)中tracrRNA的發(fā)現(xiàn) 2011年3月， Emmanuelle Charpentier課題組完成CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)干擾過(guò)程的機(jī)制解析的最后一塊拼圖,。他們通過(guò)包含CRISPR-Cas9系統(tǒng)的產(chǎn)膿鏈球菌測(cè)序發(fā)現(xiàn)除了crRNA,，尚存在第二個(gè)RNA，稱為tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA) (Deltcheva et al., 2011),。該RNA與crRNA形成雙鏈,，并介導(dǎo)Cas9靶向DNA靶標(biāo)。
CRISPR 系統(tǒng)可以在異種生物中起作用 2011年7月,，立陶宛維爾紐斯大學(xué),Virginijus Siksnys及其同事克隆了嗜熱球桿菌（含有第二類CRISPR系統(tǒng)）的整個(gè)CRISPR-Cas位點(diǎn),，并在大腸桿菌（不含有第二類CRISPR系統(tǒng)）中表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其能夠氣功質(zhì)?？剐?Sapranauskaset al., 2011),。以上實(shí)驗(yàn)表明具有獨(dú)立的功能，而且第二類系統(tǒng)所需的組分都已發(fā)現(xiàn),。
Cas9介導(dǎo)的剪切過(guò)程解析
應(yīng)用CRISPR-Cas9 進(jìn)行基因組編輯的驗(yàn)證 2013年1月，哈佛-麻省理工布羅德研究所張鋒和哈佛大學(xué)George Church在同期的科學(xué)雜志報(bào)道了運(yùn)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功進(jìn)行真核細(xì)胞內(nèi)的基因組編輯,。他們的研究表明CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠剪切人類以及老鼠細(xì)胞內(nèi)基因組的多個(gè)位點(diǎn),，并能引導(dǎo)同源重組修復(fù),。 |
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來(lái)自： 好大水 > 《基因與轉(zhuǎn)基因》
