在轉(zhuǎn)錄本分析中，tophat2是近年來(lái)最常用的工具之一,，可以將RNAseq的reads數(shù)據(jù)map到基因組上,，找出外顯子之間的結(jié)合位點(diǎn)。tophat2的下游軟件是cufflinks,，通過(guò)cufflinks我們就可以找到不同樣本間的差異基因,，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)的GO，KEGG分析等,，所以說(shuō)tophat2是轉(zhuǎn)錄本分析中的非常重要的一個(gè)中間工具,。

tophat2的安裝需要依賴三個(gè)軟件：boost,，samtools和Bowtie2。這三個(gè)軟件安裝完成后即可安裝tophat2,，命令如下:

下面來(lái)為大家講解寫tophat2有參比對(duì)的用法：

tophat –p 20 –o output –G genome.gtf  genome reads_1.fa reads_2.fa

-p 為安排運(yùn)行tophat所需要的CPU線程數(shù),，根據(jù)服務(wù)器端的CPU總線程數(shù)來(lái)決定。

-o 為文件輸出路徑,，一般建議每個(gè)樣單獨(dú)建立一個(gè)文件夾,。

-G 后面跟著相應(yīng)參考基因組的注釋文件，在運(yùn)行時(shí)會(huì)首先被tophat2調(diào)用bowtie2建立index,，這個(gè)過(guò)程會(huì)占用一定的時(shí)間,。

genome，樣品物種的基因組index,，可用bowtie2-build對(duì)物種的genome.fa文件進(jìn)行建庫(kù),，命令為：bowtie2-build genome.fa genome ，此命令建立index也需要花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間,。

tophat既支持pair-end數(shù)據(jù),，也支持single-read數(shù)據(jù)。

此外,，tophat的常用參數(shù)還有：

-r 成對(duì)的reads之間的平均inner距離,，默認(rèn)為50。

--library-type  Tophat2處理的reads具有鏈特異性,。一般Illumina數(shù)據(jù)的默認(rèn)library-type為fr-unstranded,。

輸出的結(jié)果主要有以下幾部分：

accepted_hits.bam  reads排序的結(jié)果以bam格式生成文件，是后面cufflinks軟件的輸入文件,。

junctions.bed  deletions.bed  insertions.bed 這三個(gè)分別是tophat處理的junctions,，刪除和插入的結(jié)果。

unmapped.bam 沒有map上的序列

align_summary.txt  可以查看map上的reads所占的比例,。

此類問(wèn)題常見于第一次使用tophat時(shí),，部分tophat所調(diào)用的軟件沒有配置好。如上,，將bowtie2-build在/usr/local/bin目錄下建立軟連接即可解決,。

此問(wèn)題的初心一般為注釋文件.gtf和基因組的信息在染色體上格式的不匹配造成的，例如本例中的注釋文件.gtf的1號(hào)染色體標(biāo)識(shí)為chr1,，而基因組.fa的1號(hào)染色體標(biāo)識(shí)為1,，導(dǎo)致兩個(gè)文件相互無(wú)法識(shí)別,。解決的辦法是,，將注釋文件.gtf的chr1轉(zhuǎn)換成1，操作代碼為：sed 's/^chr//g' piggenome.gtf > piggenome1.gtf ,。

關(guān)于tophat2程序后臺(tái)運(yùn)行的問(wèn)題

可以使用nohup 命令 &  運(yùn)行tophat2,，這樣可以后臺(tái)同時(shí)掛多個(gè)tophat2程序,，但是-p的值要根據(jù)服務(wù)器端的線程數(shù)進(jìn)行設(shè)置，如總服務(wù)器CPU線程為56個(gè),，后臺(tái)掛了6個(gè)tophat2程序,，則單個(gè)-p值不應(yīng)該超過(guò)9?？梢杂?/span>more nohup.out查看運(yùn)行進(jìn)度,。

解決每次運(yùn)行tophat2都要對(duì)注釋文件建index的問(wèn)題

每次用tophat2都要先進(jìn)行注釋文件建庫(kù)會(huì)占用太多時(shí)間，所以我們可以提前建好index一勞永逸,，使用命令：tophat –G  XXX_genes.gtf  --transcriptome-index=transcriptome_data/XXX  genome（基因組index） 建立注釋文件.gtf的index,，對(duì)應(yīng)的，使用的tophat命令改成：tophat –p 20 –o output --transcriptome-index=transcriptome_data/XXX  genome reads_1.fa reads_2.fa