摘要：以紫山藥為試驗材料, 對比分析了纖維素酶和果膠酶對紫山藥薯蕷皂苷元的提取效果, 并在單因素試驗結果基礎上采用正交試驗對纖維素酶提取紫山藥薯蕷皂苷元的工藝進行優(yōu)化。結果表明, 最佳提取工藝為加酶量2.0%,、料液比1︰20 g/mL,、提取時間50 min,、酶解溫度45 ℃,。此條件下紫山藥薯蕷皂苷元的平均提取率為0.164%±0.089%。體外抗氧化試驗中, 紫山藥薯蕷皂苷元表現(xiàn)出一定的抗氧化能力, 對DPPH自由基 (DPPH·) 和羥基自由基 (·OH) 的清除能力均弱于維生素C,。

關鍵詞：紫山藥; 薯蕷皂苷元; 酶法輔提; 抗氧化

薯蕷皂苷元（Diosgenin）俗稱皂素,，是一種重要的天然甾體皂苷元，屬螺甾烷醇糖苷元,，是薯蕷皂苷的水解產物，以糖苷的形式廣泛存在于薯蕷科和豆科植物中,，如葫蘆巴的種子,、盾葉薯蕷、穿龍薯蕷,、黃山藥和紫黃姜等植物的塊莖[1],。薯蕷皂苷元是合成黃體酮、可的松,、強的松,、雙烯醇酮醋酸酯、性激素和催產素等甾體激素的重要原料[2]?，F(xiàn)代研究表明,，薯蕷皂苷元具有脫敏,、抗炎,、降脂、抗氧化,、抗腫瘤,、保肝以及抗病毒等作用,，具有很高的保健價值[1,3-5]。

紫山藥（Dioscorea alata）又名紫蒔藥,、參薯等,，是薯蕷科（Dioscoreae）山藥屬（Dioscorea L.）的干燥根莖,，含有豐富的多糖,、花青素,、薯蕷皂苷元和尿囊素等多種活性成分。劉影等[6]測定浙江紫山藥中薯蕷皂苷元的含量為2.14%,，高于張玲[7]報道的黃山藥中薯蕷皂苷元含量,，可見紫山藥是薯蕷皂苷元提取的優(yōu)質原料,。酶輔助提取方法是近年來用于植物功能性成分提取的一項生物工程技術，而國內外將酶工程技術用于紫山藥薯蕷皂苷元提取的研究仍鮮見報道,。試驗比較研究纖維素酶和果膠酶對紫山藥薯蕷皂苷元的提取效果,，并采用正交試驗對復合酶法提取紫山藥薯蕷皂苷元的提取工藝進行優(yōu)化，為紫山藥的綜合開發(fā)利用和提高附加值提供科學依據,。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫山藥為河南溫縣產紫山藥,。新鮮紫山藥清洗、去皮后,，切成1～3 mm厚度的薄片,，置于60 ℃恒溫箱烘24 h，稱恒重,、粉碎,，過60目篩后,，在二氧化硅干燥器內常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

纖維素酶（10 000 U/g）,，索萊寶公司；果膠酶（10 000 U/g）,，索萊寶公司,；薯蕷皂苷元標準品，中國藥品生物制品檢定所,；香草醛,、冰醋酸、高氯酸,、無水乙醇,、醋酸鈉等均為分析純，國藥集團,。

BS224S分析天平：德國賽多利斯公司,；UV power紫外可見光分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司,；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海喬躍電子科技有限公司；202-3AB電熱恒溫鼓風干燥箱：上海喬躍電子科技有限公司,；PHS-3C精密pH計：上海雷磁儀器廠,；RE2000旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠,；D5-R2離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司,。

1.2 試驗方法

1.2.1 薯蕷皂苷元標準曲線的繪制

準確稱取干燥至恒重的薯蕷皂苷元標準品5.0 mg,，用石油醚溶解,，定容至50 mL,，搖勻得0.1 mg/mL的薯蕷皂苷元標準溶液,。分別移取0.0,，0.5,，1.0,，1.5,，2.0,，2.5 mL的0.1 mg/mL薯蕷皂苷元標準溶液置于具塞試管中,，置沸水浴中加熱使其溶劑揮干。再分別加入5 mL 高氯酸,，混勻封塞,，置25 ℃水浴中顯色25 min,，取出冷卻至室溫。以高氯酸為空白對照,，用紫外分光光度計在410 nm處測定其吸光度。以薯蕷皂苷元質量濃度（mg/mL）為橫坐標,，吸光度為縱坐標繪制標準曲線如圖1所示,，其線性回歸方程為：y=9.897 1x-0.006 4，R2=0.999 3,。

圖1 薯蕷皂苷元標準曲線

1.2.2 紫山藥粉預處理

準確稱取紫山藥粉20 g置索氏抽提器中，用乙醚90 ℃回流脫脂,，脫脂后的紫山藥粉中乙醚揮發(fā)完后,，加入85%乙醇90 ℃回流提取，以去除可溶性糖,；將揮發(fā)完乙醇后紫山藥粉60 ℃恒溫箱干燥,，恒重，得紫山藥皮預處理粉,。

1.2.3 薯蕷皂苷元的提取工藝流程

預處理紫山藥粉與水混合→加醋酸鈉-醋酸緩沖液調節(jié)pH→加入一定量的酶在一定溫度下酶解→離心（4 000 r/min,，15 min）棄上清液取濾渣→用1.0 mol/L硫酸在90 ℃恒溫水浴中水解4 h→用12 mol/L NaOH溶液中和至pH為7.0→離心（4 000 r/min，15 min）棄上清液取濾渣→用蒸餾水將濾渣洗滌3次→濾渣于80 ℃下充分干燥→用石油醚回流提取6 h→離心（4 800 r/ min,，15 min）取上清液→低溫減壓回收溶劑→得粗薯蕷皂苷元粉末

1.2.4 薯蕷皂苷元含量測定

將1.2.3步驟所得粗薯蕷皂苷元粉末在60 ℃下干燥至恒重,，精確稱取粗薯蕷皂苷元粉末50 mg,，用甲醇定容至100 mL做薯蕷皂苷元儲備液,。取儲備液1 mL于具塞試管中,，置70 ℃水浴使其溶劑揮干,。然后按照

1.2.1 方法處理,，測定其吸光度,。

1.2.5 紫山藥薯蕷皂苷元提取的單因素試驗

1.2.5.1 加酶量對薯蕷皂苷元提取率的影響

2種酶的加酶量（紫山藥皮粉干重酶量）分別為0.5%,，1%,，1.5%,，2.0%，2.5%和3.0%,，在料液比1︰ 20（g/mL），pH 5.0,，溫度40 ℃條件下酶解40 min,，按1.2.4的方法處理并測定410 nm處吸光度，并計算薯蕷皂苷元提取率,。

1.2.5.2 酶解時間對薯蕷皂苷元提取率的影響

酶解時間分別為30,，40，50,，60，70和80 min,，在加酶量1.5%,，料液比1︰20（g/mL）,，pH 5.0,，溫度40 ℃的條件下酶解,，按1.2.4的方法處理并測定410 nm處吸光度,，并計算薯蕷皂苷元提取率,。

1.2.5.3 酶解溫度對薯蕷皂苷元提取率的影

酶解溫度分別為25 ℃,，30 ℃,，35 ℃,，40 ℃,，45℃,，50 ℃和55 ℃,，在加酶量1.5%,，料液比1︰20（g/ mL），pH 5.0的條件下酶解40 min,，按1.2.4的方法處理并測定410 nm處吸光度,，并計算薯蕷皂苷元提取率,。

1.2.5.4 料液比對薯蕷皂苷元提取率的影響

料液比分別為1︰5，1︰10,，1︰15,，1︰20和1︰25（g/mL）,，在pH 5.0，加酶量1.5%,，溫度40 ℃條件下酶解40 min,，按1.2.4的方法處理并測定410 nm處吸光度，并計算薯蕷皂苷元提取率,。

1.2.5.5 pH對薯蕷皂苷元提取率的影響

pH分別為3.5,，4.0，4.5,，5.0,，5.5和6.0,，在加酶量1.5%,，料液比1︰20（g/mL），溫度40 ℃條件下提取40 min,，按1.2.4的方法處理并測定410 nm處吸光度,，按1.2.4的方法處理并并計算薯蕷皂苷元提取率。

1.2.6 纖維素酶對紫山藥薯蕷皂苷元提取的正交試驗

在單因素試驗基礎上,，設計出4因素3水平L9(34)的正交試驗，見表1,。按照1.2.2的方法提取紫山藥薯蕷皂苷元,，并計算薯蕷皂苷元提取率,，以確定纖維素酶法提取紫山藥薯蕷皂苷元的最佳工藝條件。

表1 正交試驗因素水平

D酶解溫度/ W 11.01∶104035 21.51∶155040 32.01∶206045水平因素A加酶量/ % B料液比/ (g·mL-1) C酶解時間/ min

1.3 紫山藥薯蕷皂苷元體外抗氧化活性的測定

按照正交試驗獲得的最佳工藝條件得紫山藥薯蕷皂苷元提取液后,，按照1.2.3的方法制備粗薯蕷皂苷元粉末,，按照1.2.4的方法測定洗脫液吸光度，并計算紫山藥皮薯蕷皂苷元質量濃度,，按照不同要求,，配置不同濃度的薯蕷皂苷元甲醇溶液，參照文獻[9]的方法分別進行DPPH·清除率的測定,、·OH清除率的測定,、體外抗氧化試驗。

2 結果與分析

2.1 紫山藥薯蕷皂苷元提取的單因素試驗

2.1.1 加酶量對薯蕷皂苷元提取率的影響

由圖2可知,，在加酶量為0.5%～1.5%范圍內，紫山藥薯蕷皂苷元提取率隨著加酶量的增加而升高,，這可能由于在紫山藥細胞壁纖維素酶解不完全時,，加酶量增加,，酶解程度逐漸增高,，薯蕷皂苷元提取率隨之增高,。當加酶量到一定量后,，薯蕷皂苷元提取率趨于穩(wěn)定,，表明紫山藥細胞壁酶解完全。提取率最高時纖維素酶加酶量比果膠酶少,，且纖維素酶的提取率比果膠酶高,。

圖2 加酶量對薯蕷皂苷元提取率的影響

2.1.2 酶解時間對薯蕷皂苷元提取率的影響

由圖3可知，酶解時間低于50 min時,，紫山藥薯蕷皂苷元提取率隨著酶解時間延長逐漸增大,，而60～90 min范圍時趨向平穩(wěn)。故選擇酶解時間在40～60 min進一步優(yōu)化試驗,。

圖3 酶解時間對薯蕷皂苷元提取率的影響

2.1.3 酶解溫度對紫山藥薯蕷皂苷元提取率的影響

圖4 酶解溫度對薯蕷皂苷元提取率的影響

由圖4可知,，在一定的酶解溫度范圍內,，薯蕷皂苷元提取率隨著酶解溫度的升高而而逐漸增加，纖維素酶和果膠酶的活性分別在40 ℃,，50 ℃達到最高值，溫度繼續(xù)升高,，酶的活性降低,，薯蕷皂苷元提取率也隨之降低。故選擇酶解溫度在35 ℃～45 ℃進一步優(yōu)化,。

2.1.4 料液比對薯蕷皂苷元提取率的影響

由圖5可知,，相同條件下，紫山藥薯蕷皂苷元提取率隨著料液比的減小而升高,。當料液比由1︰5（g/ mL）增加到1︰15（g/mL）時，薯蕷皂苷元提取率不斷升高,，當料液比大于1︰15（g/mL）時,，薯蕷皂苷元提取率呈下降趨勢。一定范圍內,，提取劑劑量越大,，薯蕷皂苷元浸出率越高,；但當提取劑過多時可能由于酶濃度下降，薯蕷皂苷元提取率反而下降[8],。故選擇料液比為1︰10～1︰20（g/mL）進一步優(yōu)化試驗,。

圖5 料液比對薯蕷皂苷元提取率的影響

2.1.5 pH對薯蕷皂苷元提取率的影響

由圖3可知,，纖維素酶和果膠酶對紫山藥薯蕷皂苷元提取率分別在pH為4.5和5.0時達到最大值,，說明不同酶最適宜的pH略有不同。纖維素酶的薯蕷皂苷元提取率最高值高于果膠酶,。纖維素酶最適宜pH確定為4.5,。

圖6 pH對薯蕷皂苷元提取率的影響

2.2 紫山藥薯蕷皂苷元提取的正交試驗

紫山藥薯蕷皂苷元提取的正交試驗結果（表2）分析表明,，根據極差結果得出各因素對紫山藥薯蕷皂苷元提取效果重要性的順序為RD＞RA＞RC＞RB，即酶解溫度＞加酶量＞酶解時間＞料液比,。最佳提取工藝為A3B3C2D2,，即加酶量2.0%，料液比1︰20（g/mL）,，提取時間50 min,，酶解溫度45 ℃。對最佳提取工藝條件做驗證試驗,，重復3次,，此條件下紫山藥薯蕷皂苷元的平均提取率為0.164%±0.089%，高于正交試驗中所有試驗結果,。

表2 紫山藥薯蕷皂苷元提取的正交試驗結果

試驗編號ABCD薯蕷皂苷元提取率/% 111110.142 212220.156 313330.15 421230.152 522310.15 623120.158 731320.16 832130.149 933210.154 K10.1490.1510.1500.149A3B3C2D2K20.1530.1520.1540.158 K30.1540.1540.1530.150 R0.0050.0030.0040.009

2.3 紫山藥薯蕷皂苷元體外抗氧化活性

2.3.1 紫山藥薯蕷皂苷元對DPPH·的清除作用

由圖7可知,，在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內，對DPPH·的清除能力隨著紫山藥薯蕷皂苷元質量濃度的增大而增強,，通過線性回歸方程計算得到紫山藥薯蕷皂苷元的IC50=0.771 mg/mL，而維生素C的IC50=0.227 mg/mL,，這說明在相同濃度下,，紫山藥薯蕷皂苷元對DPPH·的清除能力弱于維生素C。

圖7 紫山藥薯蕷皂苷元對DPPH·的清除作用

圖8 紫山藥薯蕷皂苷元對·OH的清除作用

2.3.2 紫山藥薯蕷皂苷元對·OH的清除作用由圖8可知，在·OH清除試驗中,，在0.1～0.5 mg/ mL濃度范圍內,，薯蕷皂苷元濃度與·OH清除率之間存在良好的量效關系，通過線性回歸方程計算得到紫山藥薯蕷皂苷元的IC50=1.352 mg/mL,，而維生素C的IC50=0.364 mg/mL,，這說明在相同濃度下,，紫山藥薯蕷皂苷元對·OH的清除能力弱于維生素C,。

3 結論與討論

目前對紫山藥薯蕷皂苷元的提取方法報道數(shù)量不多,，且采用溶劑回流，酸水解法的傳統(tǒng)方法,，如徐皓[9]用加90%甲醇80 ℃下回流10 h，濾液減壓濃縮至10 mL,，然后加入5%鹽酸-甲醇（1︰1）回流5 h,，用NaOH溶液調至pH 8后，用氯仿萃取3次,，合并氯仿層,，濃縮至干。試驗采用酶法輔助提取薯蕷皂苷元,，利用生物酶破壞紫山藥的細胞壁,，大大提高了細胞壁的通透性,，最大程度地溶出了薯蕷皂苷元,。試驗對比分析了纖維素酶和果膠酶對紫山藥薯蕷皂苷元提取率的影響,，單因素試驗結果顯示，纖維素酶的提取效果顯著由于果膠酶,。因此采用正交試驗對纖維素酶對紫山藥薯蕷皂苷元的提取工藝進行了優(yōu)化，正交試驗結果顯示,，根據極差結果得出各因素對紫山藥薯蕷皂苷元提取效果重要性的順序為酶解溫度,、加酶量、酶解時間,、料液比,。最佳提取工藝為加酶量2.0%,，料液比1︰20（g/mL）,，提取時間50 min,，酶解溫度45 ℃,。對最佳提取工藝條件做驗證試驗,，重復3次,，此條件下紫山藥薯蕷皂苷元的平均提取率為0.164%±0.089%,，高于正交試驗中所有試驗結果。明此優(yōu)化工藝參數(shù)可靠,，可為紫山藥的綜合利用提供參考。

早在1956年,，Dr. Harman[10]發(fā)表的“衰老的自由基理論”中指出,，體內產生過多自由基是引起衰老的重要因素,，保持體內自由基和抗氧化劑的平衡可以延緩衰老?，F(xiàn)代研究證明，攝入自由基清除劑如多糖,，多酚等化合物可啟動長壽基因,，抑制腫瘤基因，阻斷細胞凋亡,，從而起到延緩衰老和延長壽命的作用[11]。研究表明，山藥薯蕷皂苷元具有良好的抗氧化性[12],。薯蕷皂苷元通過其抗氧化功能起到心肌保護，抗高血脂,，治療口腔癌的作用[6,13],。試驗對紫山藥薯蕷皂苷元的體外抗氧化活性進行分析,，結果表明,，紫山藥薯蕷皂苷元對DPPH·和·OH均具有一定的清除能力,，但較維生素C弱,。在試驗濃度下,，濃度與對DPPH·和·OH的清除能力呈現(xiàn)良好的量效關系,，即濃度越高抗氧化能力越強,。目前對紫山藥薯蕷皂苷元的研究尚處于初級階段,，試驗可為紫山藥在功能性食品方面的開發(fā)利用提供技術參考。

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Study on Optimization of Enzymatic Extraction of Diosgenin from Purple Yam and Its Antioxidant Activity

Wang Yan-ping, Yang Qing-ying, Sun Rui-lin, Gu Yang, Chen Yue-ying*
Department of Food Engineering, Henan Vocational College of Agriculture (Zhengzhou 451450)

Abstract：Taking purple yam as the experimental material, cellulase and pectinase were selected to comparatively analyze extraction effect of purple yam, and the optmium technology conditions of the cellulase extraction of purple yam diosgenin were optimized by using the orthogonal experiment based on the results of single factor test. The results showed the optimum condition were as follows: cellulose amount 2.0%, material-solvent ratio 1︰20 (g/mL), enzymolysis time 50 min, enzymolysis temperature 45 ℃. Under such conditions, the yield of diosgenin was 0.164%±0.089%. Diosgenin from purple yam skin showed significant antioxidant capacity, and the scavenging abilities of DPPH· and that of ·OH were weaker than vitamin C.

Keywords： purple yam; diosgenin; enzymatic extraction; antioxidant

* 通訊作者,； 基金項目： 鄭州市普通科技攻關項目（153PKJGG424）,，2015年度河南省高等學校優(yōu)秀教學團隊建設（河南農業(yè)職業(yè)學院食品營養(yǎng)與檢測專業(yè)），2014年度河南省高等學?！皩I(yè)綜合改革試點”項目（河南農業(yè)職業(yè)學院食品營養(yǎng)與檢測專業(yè)）