1 、除草劑主要類型

依據(jù)化學結(jié)構(gòu)可將除草劑分為 4 類：（1）磺酰脲類除草劑,。該類除草劑的化學結(jié)構(gòu)包括 3 部分：疏水基體,、電子傳遞體以及活性基體，即芳香基,、磺酰脲橋和雜環(huán),。不同磺酰脲類除草劑的官能團不同。（2）酚類,、醚類除草劑,。酚是羥基與苯環(huán)直接相連形成的有機化合物。酚類除草劑,，如五氯酚鈉苯環(huán)上的 5 個氫原子被氯取代羥基上的氫被鈉取代,。醚類除草劑中的醚一般是以苯環(huán)與醚鍵相連而成的芳香醚。（3）苯氧羧酸類除草劑,。苯氧羧酸與醚類,、酚類的區(qū)別在于苯環(huán)上的氫被氯、羧酸或羧酸衍生物取代,，由此產(chǎn)生不同的苯氧羧酸類除草劑,。（4）有機磷類除草劑。有機磷類除草劑是由亞磷酸酯,、硫代磷酸酯或含磷雜環(huán)有機化合物構(gòu)成的除草劑,。

按作用方式將除草劑分為選擇性和非選擇性除草劑。選擇性除草劑對非目標作物并無傷害,。如 2-甲-4-氯,、2,，4-D 丁酯能選擇性殺死一些雙子葉雜草,，而對單子葉作物無傷害,。非選擇性除草劑是指選擇性小甚至無選擇性的除草劑。該類除草劑作用于全部植物,，如草甘膦,、百草枯等。

根據(jù)除草劑在植物體內(nèi)移動方式的不同分為內(nèi)吸型和觸殺型除草劑,。雜草的各個器官將藥劑吸入體內(nèi)后運輸?shù)街仓昶渌课焕^而破壞雜草體內(nèi)生命代謝活動達到防治雜草目的的屬內(nèi)吸型除草劑,，該類藥劑一般見效緩慢，如草甘膦,。觸殺型除草劑使感染到除草劑的植株發(fā)生損傷而死亡,，而不經(jīng)過植株體內(nèi)傳導。雜草地上部分直接暴露在除草劑中,，因此損傷嚴重,，而根部則避免了傷害，因而此類除草劑主要用于防除一年生雜草,，如除草醚,、敵稗等。

2,、 除草劑的作用機制

1）抑制氨基酸生物合成

在高等植物體內(nèi),，乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS）對支鏈氨基酸如纈氨酸,、亮氨酸和異亮氨酸的合成具有關(guān)鍵作用,。而該類氨基酸生物合成抑制型除草劑，如磺酰脲類除草劑通過抑制 ALS 的活性,，導致支鏈氨基酸合成受阻,，進而影響蛋白質(zhì)的合成，致使有絲分裂指數(shù)下降,，最終使組織失綠,、黃化，植株逐漸死亡達到除草的目的,。

2）抑制光合作用

光合作用中光反應(yīng)和暗反應(yīng)分別發(fā)生在光合系統(tǒng)Ⅰ和光合系統(tǒng)Ⅱ中,。如均三氮苯類除草劑等通過阻滯光和系統(tǒng)中電子的傳遞來抑制光合作用，使得 CO 2 固定,、NADP 的還原以及ATP 合成受阻,，葉片進而失綠黃化，最終雜草由于缺乏營養(yǎng)而枯萎死亡,。

3）抑制乙酰輔酶Ａ羧化酶合成

乙酰輔酶Ａ羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACCase）在脂肪酸合成反應(yīng)中起到控速酶的作用,。丙酮酸和乙酸在不同酶的催化作用下合成乙酰輔酶Ａ,，然后被 ACCase碳化形成丙二酸單酰輔酶 A（malonyl-CoA），最后在脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,，F(xiàn)AS）催化作用下形成脂肪酸（fatty acid,，F(xiàn)A）。抑制乙酰輔酶Ａ羧化酶合成類除草劑可阻斷脂肪酸的生物合成中輔酶Ａ到單酰丙二酸輔酶 A 的合成以行使除草功能,，但該類除草劑的施用會導致雜草產(chǎn)生抗性,。

4）抑制色素合成

原卟啉原氧化酶（protoporphy-rinogen oxidase，PPO） 抑 制 型 除 草 劑 近 年 來 發(fā)展十分迅速,。該類除草劑通過使植株中原卟啉（protoporphyrin IX）累積,、脂質(zhì)過氧化、葉綠素合成受阻等典型的生理變化起到防治雜草的目的,。二苯醚類和環(huán)酰胺類除草劑作用機理的關(guān)鍵在于原卟啉Ⅸ的積累,。原卟啉原氧化酶可將原卟啉原 IX 氧化為原卟啉 IX，然而除草劑會比底物（原卟啉原Ⅸ）對原卟啉原氧化酶更敏感,，以此占據(jù)原卟啉原氧化酶的活性中心,。最終導致原卟啉原Ⅸ的累積，累積的原卟啉原Ⅸ泄漏至胞質(zhì)中并轉(zhuǎn)化為原卟啉Ⅸ,。葉綠體中原卟啉Ⅸ經(jīng)過一系列催化反應(yīng)可合成葉綠素,，泄漏至細胞質(zhì)后則在光作用下將 O 2 催化為單線態(tài)氧以及具毒性氧基。單線態(tài)氧會引發(fā)不飽和脂肪酸的過氧化進而損傷胞膜,。葉綠體中的光合色素由于類囊體膜被毒性氧基破壞造成滲漏,，繼而引發(fā)光分解，脫色作用使組織白化,，雜草將無法存活,。

1,、 修飾除草劑靶標蛋白以降低對除草劑的敏感性

噴施除草劑后作物生命活動仍正常進行,。ALS促進纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸這 3 種支鏈氨基酸的生物合成,，其活性受到抑制將使蛋白質(zhì)合成受阻而導致植株死亡,。乙酰乳酸合酶中單個氨基酸的改變會鈍化作物對磺酰脲類除草劑的敏感性。目前,，已獲知的煙草（脯氨酸變?yōu)楣劝彼峄虮彼幔?、擬南芥（脯氨酸變?yōu)榻z氨酸）,、大豆（脯氨酸變?yōu)榻z氨酸）對該類除草劑中的氯磺隆的抗性就是單個氨基酸改變的結(jié)果,。在對水稻兩個除草劑抗性植株進行 ALS 活性分析中發(fā)現(xiàn)突變后的 ALS 對不同種類除草劑的耐受性比野生型提高約 1 萬倍。

2,、提供降解除草劑的降毒酶

土壤微生物可將多類除草劑在其發(fā)生作用前分解成微毒或無毒成分,。依據(jù)微生物這種作用機制將解毒酶引入植株體內(nèi)可行使解毒功能而達到抵抗除草劑的功能,。該種抗性機制最大的優(yōu)點是不會增加作物的代謝負擔,，因此，抗性作物的產(chǎn)量和質(zhì)量不會受到影響,。

3,、 靶標蛋白過量表達免受除草劑抑制

將除草劑草甘膦靶標蛋白酶EPSP（5-endpyruvy/shikimate-3-phosphate）過量表達可顯著增強作物對除草劑的抗性。且基因的自我復制以及轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控均可提高 EPSP 的表達量,。研究證明：植株對草甘膦抗性正比于 EPSP 的活性,。

1,、抗除草劑作物常規(guī)育種研究進展

1）雜交法與自然選擇培育抗除草劑作物

科學家依據(jù)雜草對除草劑的抗性機制已培育出多種抗除草劑作物。如今已有玉米,、大豆和煙草等近 20種除草劑抗性作物是通過非轉(zhuǎn)基因手段培育的,，育種家通過篩選得到抗性作物品種，然后將其與優(yōu)良的栽培品系進行雜交獲得集聚雙親優(yōu)良性狀的除草劑抗性作物,?；虻姆蛛x重組產(chǎn)生各種變異類型，從中選擇目的性狀,，以此培育優(yōu)良雜種,。自然選擇和雜交法培育抗性作物很好地利用了植物中的天然耐性基因以及雜種優(yōu)勢，但也存在工作量大,、周期長等弊端,。從大量作物中找到天然抗性的植株是培育除草劑抗性作物的關(guān)鍵，同時這也是進行其他研究試驗的前提,。

2）誘變育種培育抗除草劑作物

誘發(fā)植物產(chǎn)生突變的物質(zhì)稱為誘變劑（mutagen）,。誘變育種（induced mutation breeding）是通過一定理化因素誘導作物產(chǎn)生各種不定向突變，然后再從中選擇出目標性狀的育種過程,。與其他育種方式相比,，其優(yōu)勢在于縮短了育種年限且后代性狀穩(wěn)定、育種周期短,，可以改良甚至產(chǎn)生單個基因控制的獨特性狀,。

實驗室常用到的化學誘變劑主要有 EMS、疊氮化鈉（NaN 3 ）堿基類似物等,。誘變育種中最常使用誘發(fā)點突變的 EMS 誘變劑,，該誘變劑多產(chǎn)生顯性突變因此易于進行突變體篩選。此外物理誘變手段如離子束,、超聲波,、微波、射線等需要放射源,，成本較高且常導致一些非預期的有害突變,，所以應(yīng)用較少,。化學誘變主要有：（1）花粉誘變,。石蠟油花粉誘變技術(shù)以石蠟油,、EMS 分別作載體劑和誘變劑處理未污染的花粉。授粉后再用除草劑對后代進行抗性篩選,，最后獲得抗性品種,。咪唑啉酮類除草劑抗性玉米的獲得主要采用此育種方法。20世紀 80 年代,，Newhouse 等誘變處理細胞株系,，從中成功篩選出 3 株抗性株系并育成咪唑啉酮類除草劑抗性小麥品種。（2）種子誘變,。種子誘變比花粉誘變更加容易操作,。將種子直接浸泡于誘導藥液中便可產(chǎn)生不同程度突變。經(jīng)過藥劑處理的種子長成植株 M1,，但 M1 含較多的嵌合體和隱性突變,，且變異主要為不能遺傳給后代的生理傷害變異，所以在 M1 中篩選是無效的,。M2 代中抗性性狀會由于生殖細胞的形成過程中有突變類型的參與而出現(xiàn)分離,，將噴施除草劑篩選到的突變體進行幾代純化后能得到除草劑抗性品種。Newhouse 等以NaN 3 為誘變劑誘變小麥材料,，通過系譜法對突變體小麥逐代選擇,，最終從近萬株的 M2 中成功獲得了咪唑啉酮類除草劑抗性小麥品系。（3）其他部位誘變,。植物的外植體以及多數(shù)營養(yǎng)或生殖器官均能被誘發(fā)產(chǎn)生突變,，值得注意的是細胞水平的誘變更具應(yīng)用潛質(zhì)。

3）植物組織培養(yǎng)法培育抗除草劑作物

近年來,，植物組織培養(yǎng)技術(shù)在抗除草劑作物的培育過程中發(fā)展較快,，應(yīng)用較多。將離體的植物器官或組織在添加一系列不同濃度除草劑的培養(yǎng)基中進行人工培養(yǎng),，誘發(fā)其產(chǎn)生愈傷組織,。愈傷組織對除草劑十分敏感，容易產(chǎn)生突變體,，篩選后的突變體再生成植株得到抗性新品種,。有試驗研究表明，具有唯一靶標的除草劑更易誘導愈傷組織發(fā)生突變而獲得抗性再生植株,。所以,，植物組織培養(yǎng)法培育除草劑抗性作物主要傾向于如靶標單一 ALS 抑制劑類除草劑。采用植物組織培養(yǎng)法培育除草劑抗性作物，如煙草,、大豆,、玉米，雖已取得較大突破,，但其發(fā)展歷史較短,，因此在技術(shù)和應(yīng)用上并不成熟，有待進一步完善,。

2,、轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物育種研究進展

1）除草劑抗性基因 按作用機理的不同將除草劑抗性基因分為兩類

除草劑靶蛋白突變基因：如突變除草劑靶蛋白 ALS 基因的表達將鈍化植株磺酰脲類除草劑的化學作用，即使噴施除草劑后生命代謝活動依舊正常進行,。

編碼修飾除草劑的酶或酶系統(tǒng)基因：從微生物如土壤細菌Klebsilla 中可以克隆出一種表達水解 oxynil 類除草劑的晴水解酶基因 bxn ,。這類基因編碼的酶或酶系統(tǒng)會將除草劑在發(fā)揮藥性前將其降解成微毒或無毒成分。

2）轉(zhuǎn)基因除草劑抗性作物研究概況

在分子生物學的發(fā)展過程中,，通過基因工程手段培育的多個除草劑抗性作物品種已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,。截至 2009 年,，全世界抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物種植面積占全部轉(zhuǎn)基因作物種植總面積的 60%,，總面積超過 8 300 萬 hm 2 ，到 2010 年已達到 1.48 億 hm 2 ,。其中,，除草劑抗性轉(zhuǎn)基因作物仍占較大比例，成為應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)基因性狀,。1983 年培育出的抗除草劑煙草是第一例轉(zhuǎn)基因作物,。截至目前，已經(jīng)推廣種植的抗除草劑作物主要有玉米,、水稻,、大豆、油菜,、棉花等,。在這些抗性作物中居于首位的是大豆，其次是玉米,。農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法和基因槍介導轉(zhuǎn)化法是抗除草劑抗性基因?qū)胧荏w的兩種最常用方法,。農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育除草劑抗性作物中應(yīng)用最為廣泛的外源基因?qū)敕ǎ摲椒ú僮骱唵?，轉(zhuǎn)化率高,，且轉(zhuǎn)基因重排少，拷貝數(shù)低,。但該方法也具有一定的局限性,，一般只感染雙子葉植物，對于禾谷類單子葉植物的轉(zhuǎn)化效率低?；驑尳閷мD(zhuǎn)化法的原理是借助燃料爆燃,、高壓氣體或高壓放電產(chǎn)生的能量驅(qū)動金粉粒以一定的速度進入細胞的一種方法?；驑尫]有宿主的限制且易于操作,，適用于用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化無法實現(xiàn)的作物。豐富的除草劑抗性作物種類的培育得益于不斷發(fā)掘的除草劑抗性基因以及日趨成熟的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),。培育轉(zhuǎn)基因除草劑抗性作物的主要價值體現(xiàn)在以下幾個方面：（1）提高除草效果,、降低除草成本。市場上廣泛使用的草銨膦和草甘膦除草劑殺草譜廣,，屬非選擇性除草劑,，因此應(yīng)培育對該類除草劑有抗性的轉(zhuǎn)基因作物。（2）利于采用保護性耕作,。美國自引入除草劑抗性大豆以來無耕作大豆播種面積提高了近三分之一,。保土耕作技術(shù)的推廣不僅減少了水土流失，同時還提高了水的使用率以及土壤中有機質(zhì)的含量,。（3）有助于采用窄行間距種植,。

除草劑抗性轉(zhuǎn)基因大豆的行間距縮至原來一半，合理密植加快了作物頂冠閉合,，從而增強了作物的生命力,，達到高產(chǎn)目標。除此之外,，與其他除草劑相比,，草銨膦和草甘膦對環(huán)境的污染較輕，在土壤中極易降解,，所以流向地表水的可能性較小,，不會對水環(huán)境造成威脅。

3）除草劑抗性轉(zhuǎn)基因作物的安全性評價問題
盡管除草劑抗性轉(zhuǎn)基因作物有諸多好處,，但其安全性評價問題突出,，是制約其發(fā)展的主要因素。以除草劑抗性轉(zhuǎn)基因玉米為例,，其安全評價主要有兩大方面,。

一是食品安全。食品安全問題主要有過敏性問題,、毒性問題,、對抗生素產(chǎn)生抗性問題以及營養(yǎng)問題等。若轉(zhuǎn)基因玉米中轉(zhuǎn)入基因所表達的蛋白有致敏性或者因轉(zhuǎn)入基因的表達而產(chǎn)生新致敏原都會使其產(chǎn)生致敏性,。所以,，轉(zhuǎn)基因玉米安全性評價問題的關(guān)鍵之處在于其是否有致敏性。再者，轉(zhuǎn)基因插入位點的不確定性會導致原有的受體基因改變表達甚至失活,，同時在自然情況下處于“沉默”狀態(tài)具有毒素的基因存在被激活的風險,。轉(zhuǎn)基因或基因操作手段可能會使轉(zhuǎn)基因受體植株在經(jīng)歷漫長的進化以及馴化的過程中再次激活這些表達超出預期毒性成分的毒性基因。其次,，將某種抗生素抗性基因構(gòu)建到轉(zhuǎn)基因表達載體中可進行后期篩選,。但是，基因水平轉(zhuǎn)移使腸道內(nèi)細菌有獲得抗生素抗性的可能,。盡管 FAO/WHO 專家組認為動物體攝入抗性基因后,，其水平轉(zhuǎn)移到腸道細菌并對動物產(chǎn)生不利影響的概率很小，但仍需對其潛在的危險性進行評估,。

二是生態(tài)安全,。轉(zhuǎn)基因植物的主要生態(tài)安全問題：（1）轉(zhuǎn)基因逃逸與基因漂移；（2）抗蟲或抗病轉(zhuǎn)基因?qū)Νh(huán)境中非靶標生物的影響,；（3）轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模長期種植對土壤生物群落的影響,；靶標生物對轉(zhuǎn)基因植株抗性的進化。其中,，轉(zhuǎn)基因作物基因漂移備受關(guān)注,。花粉,、種子和無性繁殖器官都會介導轉(zhuǎn)基因漂移,。而轉(zhuǎn)基因漂移會使非轉(zhuǎn)基因種子混雜轉(zhuǎn)基因種子，降低種子純度,。并且，傳統(tǒng)品種種子中混雜了轉(zhuǎn)基因種子會破壞傳統(tǒng)品種種質(zhì)資源的完整性,。同時,，植物與野生近緣種的生態(tài)適合度和入侵能力可能會被經(jīng)過遺傳修飾的轉(zhuǎn)基因所改變。如果大量的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到野生種群體中,，它們便會不斷取代野生群體物種中的等位基因最終導致群體遺傳多樣性的喪失,。具有抗逆性的基因漂移到與作物親緣關(guān)系較近的雜草中會引發(fā)雜草化問題，雜草獲得較高田間適應(yīng)能力以及入侵能力將使得對雜草的管理和防控更加困難,，最終造成更大的經(jīng)濟損失,。因此轉(zhuǎn)基因作物需要受到嚴格監(jiān)管。

基因組編輯技術(shù)通過兩部分起到定向編輯基因組的作用,。首先是具有導向功能的 gRNA 特異識別基因組序列位點，其次是定點切割的核酸酶,。二者結(jié)合才能發(fā)揮定向切割,，產(chǎn)生雙鏈斷裂。細胞通過同源重組或非同源末端連接兩種不同修復機制對 DNA 產(chǎn)生的斷裂雙鏈進行修復?；蚪M編輯中行使切割功能的核酸酶有鋅指核酸酶（zinc finger nucleases,，ZFNs），類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白核酸酶（transcription activator-like effector nuclease,，TALEN）,，以及 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。2009 年,，Townsend 等成功通過 ZFN 對煙草原生質(zhì)體中兩個 ALS 基因?qū)崿F(xiàn)了同源重組編輯,，獲得抗性煙草。CRISPR/Cas9技術(shù)易操作,、成本低,、效率高的優(yōu)點備受生物技術(shù)工作者的青睞。經(jīng)過改造的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被迅速地應(yīng)用到擬南芥,、煙草,、高粱、水稻,、小麥和玉米等不同植物基因組的定向編輯研究中,，并且獲得較高的誘導突變率和可穩(wěn)定遺傳的基因組編輯植株。國外已有研究者通過構(gòu)建 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)將玉米 ALS2 基因第 165 位氨基酸——脯氨酸通過引入修復模板,，經(jīng)同源定向修復為絲氨酸以降低磺酰脲類除草劑對植株體內(nèi)支鏈氨基酸生物合成的阻礙,，從而產(chǎn)生磺酰脲類除草劑抗性。將 gRNA 與Cas9 構(gòu)建到同一載體中將提高轉(zhuǎn)化效率,，試驗數(shù)據(jù)也證明了 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在玉米中高效的基因敲除,、插入與定點編輯效率，后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)基因敲除,、插入和編輯可以穩(wěn)定遺傳給后代并符合孟德爾分離規(guī)律,。相似的機制在其他作物如擬南芥和水稻中是否有效？通過 CRISPR/Cas9 介導的基因編輯技術(shù)是否可以將多個分離的點突變同時引入到植物基因組中,？最近的研究報告中：研究者以兩個 gRNA 代替單個 gRNA,，將其與 Cas9 以及用于同源修復的模板構(gòu)建到同一載體中并經(jīng)過基因槍轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，結(jié)果證實這是一種在水稻 ALS 基因中引入不連續(xù)點突變的有效方法,。筆者從事基于玉米的基因組編輯技術(shù)工具的優(yōu)化與應(yīng)用,，以實現(xiàn)玉米基因組高效準確的編輯。其中,，除草劑抗性基因的編輯也是其研究內(nèi)容的一部分,。

常規(guī)育種通過雜交可以獲得兼具雙親優(yōu)良性狀的品種,，在一定意義上實現(xiàn)了穩(wěn)產(chǎn),、高產(chǎn)的育種目標,，但常規(guī)育種周期太長，不論在數(shù)量還是質(zhì)量上還難以滿足人類日益增長的糧食需求,。轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)作為科技進步的產(chǎn)物已在多個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用,。但是在作物育種中，外源基因被引入受體植物,，且基因在作物基因組中并沒有特定的插入位點,。由此帶來的轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性問題依舊備受爭議，成為制約其發(fā)展的主要因素,。目前,，CRISPR/Cas9 作為一種新興的基因組編輯技術(shù)可對基因組特定位點進行 DNA 的插入與刪除以及某個或某些堿基的替換等操作。作為作物分子育種新途徑,，它的關(guān)鍵之處在于應(yīng)用回交或自交的方式可篩選出經(jīng)過基因組定點編輯卻不含轉(zhuǎn)基因片段的株系,。因此，農(nóng)作物除草劑抗性育種有望通過基因組編輯技術(shù)取得更好的成果,。

本文轉(zhuǎn)載自：《作物雜志 Crops》 2017（2）：1-6