長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）一般指不具有蛋白編碼能力,，轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子,，包括intronic/exonic lncRNAs、antisense lncRNAs,、overlapping lncRNA和long intergenic ncRNAs（lincRNAs）,。LncRNA與細胞周期和分化、發(fā)育,、生殖,、性別調(diào)控、衰老以及多種人類疾病密切相關(guān),。

lncRNA數(shù)量比較多,，大約是為mRNA的3-100倍，但是目前多數(shù)lncRNA的功能仍不清楚,，有很大的研究空間,。最近，有文章報道lncRNA可以編碼微肽并具有特定生物學(xué)功能,，又拓展了新的研究方向,。因此，lncRNA是目前生物和醫(yī)學(xué)研究中的熱點話題之一,。

1. 利用組學(xué)研究LncRNA時空表達模式 

包括不同發(fā)育階段,、疾病發(fā)展進程等生物學(xué)連續(xù)過程中的lncRNA的種類、數(shù)量和表達豐度,。

2. 候選lncRNA的功能研究 

高通量篩選出對照組/處理組,、處理不同時間點間以及其它生物學(xué)相關(guān)差異候選lncRNA，再進行后續(xù)功能學(xué)研究或作為疾病治療靶點和biomarker研究,。

3. LncRNA-mRNA或LncRNA-lncRNA interaction調(diào)控生物學(xué)功能研究 

例如利用Genome-scale RNA interactome analysis（RIA-Seq）分析到TINCR lncRNA與多種mRNA結(jié)合調(diào)控細胞發(fā)育,。

4. miRNA-dependent CeRNA研究（轉(zhuǎn)錄組層面）。

5. LncRNA的多組學(xué)研究（基因組,、轉(zhuǎn)錄組,、表觀組學(xué)等多層面）。

6. LncRNA編碼肽段的研究 

高通量預(yù)測組學(xué)lncRNA數(shù)據(jù)的蛋白編碼能力,，生信分析流程中保留可以編碼的lncRNA進行后續(xù)研究,。

下面我們通過兩篇基迪奧項目文章，看看別人如何研究lncRNA的表達模式,。

發(fā)表期刊：《BMC Genomics》

影響因子：3.867

研究背景：山羊發(fā)育過程中,，有關(guān)骨骼肌lncRNA的研究很少。

研究思路：取4個不同發(fā)育時間,、3個生物學(xué)重復(fù)的肌肉,，進行鏈特異性RNA-Seq建庫，生信分析lncRNA數(shù)量,，表達情況,。

1. LncRNA高通量測序

通過鏈特異性RNA-Seq建庫，對下機raw data進行過濾后,，75.20–86.60% clean reads能夠比對上山羊參考基因組（CHIR_1.0, NCBI）,。再通過生信流程分析鑒定到3515個intergenic lncRNAs（88.29 %）和466個anti-sense lncRNAs（11.71 %）轉(zhuǎn)錄本，對應(yīng)2739個lncRNA genes,。平均長度1296 bp,，含有2.4 exons。

同時檢測到24,383個protein coding轉(zhuǎn)錄本,，平均長度1978 bp,，含有8.4 exons，其中只有10.6%含有2-3個exons,。

2. LncRNA差異表達研究

利用Cuffdiff軟件計算lncRNA轉(zhuǎn)錄本的表達量FPKM（fragments per kilo-base of exon per million fragments mapped）,，共577 lncRNA transcripts在發(fā)育過程中差異表達。

3. lncRNAs cis調(diào)控研究

查找protein-coding genes上下游10-kb的區(qū)域的lncRNA,，發(fā)現(xiàn)1153 lncRNAs與1455 protein-coding gene位置臨近,，可能參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后水平。接著對共表達基因進行GO和KEGG富集分析,，研究它們相關(guān)生物學(xué)功能,。結(jié)果顯示RBP4, PLN, MYLK2, RARA, 等基因處于muscle development-related GO term（GO:0014706），與肌肉發(fā)育密切相關(guān),。

4. lncRNAs trans調(diào)控研究

通過生信分析lncRNA trans調(diào)控的靶基因,，結(jié)果顯示1747 lncRNA transcripts與19,846 protein-coding transcripts有結(jié)合的關(guān)系。同樣對共表達基因進行GO和KEGG富集分析,，研究它們相關(guān)生物學(xué)功能和通路,。

5. qPCR驗證

隨機挑選6個差異表達lncRNAs進行qPCR驗證，qPCR結(jié)果顯示與RNA-Seq的一致性,。說明高通量測序和生信分析lncRNA的可靠性非常高。

發(fā)表期刊：《Mol Neurobiol》

影響因子：5.397

研究背景：阿茲海默?。?span>AD）的發(fā)病機理沒有完全研究清楚，并且lncRNA在阿茲海默病中的作用研究較少,。

研究思路：構(gòu)建大鼠疾病模型,，對AD組（n = 10）和 control組（n = 10）進行芯片分析,，生信分析差異lncRNA和mRNA。

1. 組間差異表達lncRNA和mRNA

Case-control組間發(fā)現(xiàn)315個顯著差異的lncRNA（238個上調(diào),，77個下調(diào)）,。同時發(fā)現(xiàn)311個顯著差異的mRNA（191個上調(diào)，120個下調(diào)）,。

2. qPCR驗證

qRT-PCR結(jié)果與microarray data存在一致性,，lncRNAs BC092582、MRAK050857和mRNA S100A8 在AD中下調(diào),；

lncRNAs MRAK088596,、MRAK081790和mRNA MAPK10 在AD大鼠中上調(diào)。

3. lncRNA調(diào)控的mRNA功能富集分析

通過生信方法分析lncRNA調(diào)控的mRNA,，再進行GO和KEGG富集分析,。發(fā)現(xiàn)這些mRNAs的功能與endocrine process（ontology: biological process, GO:0050886）， extracellular region part（ontology: cellular component, GO:0044421）和neurokinin receptor binding（ontology: molecular function, GO:0031834）相關(guān),。

4. lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)分析

利用差異lncRNA和差異mRNA構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò),，共有454 network nodes和478個相互作用關(guān)系將168個差異mRNAs 和286個差異lncRNAs聯(lián)系起來。1個mRNA可以結(jié)合1-66個lncRNAs,，1個lncRNA可以與2個mRNA發(fā)生作用,。

1. 這兩篇文章（3-5分）中的LncRNA的測序分析內(nèi)容并不復(fù)雜，包括：轉(zhuǎn)錄本統(tǒng)計和注釋,、差異表達分析,、cis/trans調(diào)控分析、靶基因功能富集分析,、共表達網(wǎng)絡(luò)分析等,。這表明常規(guī)的標準生信流程分析足夠普通文章的發(fā)表分量。

2. 都只有簡單的qPCR對測序結(jié)果的驗證,，如果加入更多的基因功能研究,，文章的將會再上一個層次。

3. 第一篇文章采用了四個不同發(fā)育時間的12個樣本,，數(shù)量比較充足,；第二篇中成功構(gòu)建了特定的疾病模型，也容易找到與正常樣本差異表達的基因,。這說明樣本的設(shè)計和選擇是非常重要的,，直接影響后續(xù)結(jié)果優(yōu)劣。

4. 這兩篇文章都是關(guān)于lncRNA整體表達的,，只是比較常見的一種思路,。文章開頭還例舉了其它的一些思路供參考，可以根據(jù)研究目的,，設(shè)計合適的方案,。

參考文獻：

【1】Zhan S, Yao D, Wei Z, et al. Genome-wide identification and characterization of long non-coding RNAs in developmental skeletal muscle of fetal goat[J]. BMC Genomics, 2016, 17(1):666.

【2】Yang B, Xia Z A, Zhong B, et al. Distinct Hippocampal Expression Profiles of Long Non-coding RNAs in an Alzheimer's Disease Model[J]. Molecular Neurobiology, 2016:1-14.