患2型糖尿病的肥胖人群腸道菌群分析

曾藝鵬1,， 胡 燕2， 吳 平2,， 馮新格1,， 谷成英1， 郭亞芳1

（1. 上海市浦東醫(yī)院中醫(yī)科,，上海 201399,；2. 上海市浦東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201399 ）

摘要：目的 探討患2型糖尿病的肥胖人群腸道菌群的變化特征,。方法 以21例患2型糖尿病的肥胖者作為研究組,，21名血糖正常的肥胖志愿者作為對(duì)照組,。取研究組和對(duì)照組新鮮糞便，采用Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)糞便樣本中所有細(xì)菌的16S rRNA-V3區(qū)進(jìn)行DNA測(cè)序,，分析腸道菌群物種的豐度和分布,，并進(jìn)行聚類分析。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)腸道菌群進(jìn)行定量分析,。結(jié)果 成功進(jìn)行了DNA測(cè)序分析,，樣本稀疏曲線顯示測(cè)序深度充分，測(cè)序覆蓋深度（Coverage指數(shù)）＞0.99,。研究組腸道菌群2個(gè)豐度指數(shù)（Ace和Chao1）均低于對(duì)照組（P＜0.05）,，2個(gè)多樣性指數(shù)（Shannon和Simpson）分別低于和高于對(duì)照組（P＜0.05）。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,，在門水平,，研究組的厚壁菌門和放線菌門均低于對(duì)照組（P＜0.05），而擬桿菌門高于對(duì)照組（P＜0.05）,，其他2個(gè)菌門（變形桿菌門和梭形桿菌門）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,；在屬水平，研究組的韋榮球菌屬,、Ⅳ型梭菌屬和擬桿菌屬均高于對(duì)照組（P＜0.05）,，而乳桿菌屬、Blautia球菌-直腸真桿菌屬,、普雷沃菌屬和雙歧桿菌屬均低于對(duì)照組（P＜0.05）,。結(jié)論 患2型糖尿病的肥胖人群腸道菌群的豐度和多樣性下降，定量分析腸道菌群的構(gòu)成對(duì)該人群有特殊意義,。

關(guān)鍵詞：腸道菌群,；2型糖尿病,；肥胖,； 高通量測(cè)序

2型糖尿病占糖尿病患者人數(shù)的90%以上，是一種受遺傳和環(huán)境雙重因素影響的綜合性疾病,，而環(huán)境被認(rèn)為是導(dǎo)致其發(fā)病率增加的主要原因,。2型糖尿病患者除有明顯的家族史外,，肥胖是誘發(fā)糖尿病的主要環(huán)境因素,。然而，大部分肥胖者可以一直保持血糖在正常范圍內(nèi),。近年來,，已有文獻(xiàn)報(bào)道腸道菌群與肥胖存在關(guān)聯(lián)［1-2］，同時(shí)有諸多文獻(xiàn)報(bào)道胰島素抵抗也是一種低級(jí)的炎癥反應(yīng)［3-4］,，而胃腸道菌群兼具基因及環(huán)境雙重因素,。研究患2型糖尿病的肥胖人群腸道菌群情況,，可以為該病的發(fā)病機(jī)制提供進(jìn)一步佐證，并為治療策略的制定和預(yù)后的評(píng)估提供參考,。

材料和方法

一,、研究對(duì)象

收集上海市浦東醫(yī)院門診就診的21例患2型糖尿病的肥胖者作為研究組，通過空腹糖耐量試驗(yàn)確診,。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜18歲,，患腸道器質(zhì)性疾病，有腹部手術(shù)史,，處于懷孕期或哺乳期,，近2周內(nèi)使用過膨脹劑、止瀉藥,、解痙藥,、益生菌及抗菌藥物。同時(shí)收集21名血糖正常的肥胖者作為對(duì)照組,，經(jīng)臨床體檢證實(shí)身體健康,，無胃腸道癥狀，近1個(gè)月內(nèi)未服用任何抗菌藥物,。

二,、方法

1.樣本采集 無菌條件下獲取研究對(duì)象自然排出的新鮮糞便，避開表面,，采集中心部分糞便（10±5）g,，放入無菌凍存管后立即速凍，采樣程序符合醫(yī)院倫理要求,。糞便樣本送至實(shí)驗(yàn)室,，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.DNA提取 采用 QIAamp DNA Stool Mini Kit（德國(guó)QIAGEN公司）提取100 mg糞便樣本中微生物的總DNA，具體步驟按說明書操作,。所提取的 DNA 用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)（美國(guó)Rockland公司）測(cè)定濃度后,，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序 用所提取的總DNA作為模板,，16S rRNA PCR引物由測(cè)序接頭引物,、Index和V3區(qū)引物3部分組成。Index為6 bp核苷酸隨機(jī)組成的序列,，以標(biāo)記PCR產(chǎn)物的來源,。PCR擴(kuò)增體系共25 μL，其中2×Master Mix（NEB公司,，美國(guó)）12.5 μL,，引物各1.5 μL，模板2.5 μL,，滅菌雙蒸水7 μL（如模板 DNA 濃度較低則不加滅菌雙蒸水,，加等體積的模板）,。擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃ 10 s,、 50 ℃30 s,、 72 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán),；最后 72 ℃延伸7 min,，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后,，將全部反應(yīng)產(chǎn)物用 1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳（溴化乙錠染色）檢測(cè)擴(kuò)增片段大小,，采用QIAquick Gel Extraction Kit（德國(guó)QIAGEN公司）對(duì)目的條帶膠回收純化。將純化后的16S rRNA-V3區(qū)的PCR產(chǎn)物采用Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行測(cè)序,。

4.生物信息學(xué)分析 PCR產(chǎn)物采用Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序,。隨后對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行提取。提取方法：將Miseq測(cè)序得到的“PEreads”首先根據(jù)“overlap”關(guān)系進(jìn)行拼接,，將成對(duì)的“reads”拼接成一條序列,，同時(shí)對(duì)“reads”的質(zhì)量和“merge”的效果進(jìn)行質(zhì)量控制和過濾，去除序列末端的后引物和接頭序列,、多堿基N,、polyA/T尾巴及低質(zhì)量堿基；去除所得序列的“barcode”標(biāo)簽序列,、前引物序列,；丟棄長(zhǎng)度短于200 bp、模糊堿基數(shù)＞0,、序列平均質(zhì)量＜20的序列,。高質(zhì)量序列的生物信息學(xué)分析：（1）操作單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析,。提取非重復(fù)序列,，使用QIIME數(shù)據(jù)處理平臺(tái)進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析，與silva數(shù)據(jù)庫(kù)中已比對(duì)的序列數(shù)據(jù)庫(kù)的參考序列進(jìn)行比對(duì),，將相似性在97%以上的序列進(jìn)行歸并,，生成分類OUT。（2）菌群多樣性分析,。根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果進(jìn)行alpha和beta多樣性計(jì)算,，采用豐度指數(shù)（Ace、Chao1）和多樣性指數(shù)（Simpson,、Shannon）分別對(duì)樣本進(jìn)行分析,。（3）稀疏曲線分析,。采用 R軟件在97%相似性水平繪制樣本稀疏曲線,，比較測(cè)序數(shù)量不同的樣本物種的豐富度并評(píng)估樣本的取樣大小是否合理,。（4）菌群分類學(xué)分析。采用R軟件將OTU中全部序列與silva數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列進(jìn)行比對(duì),，找出其最相近且可信度達(dá)80%以上的種屬信息,。并將每一個(gè)OTU中的所有序列進(jìn)行類比，找出同一OTU中的不同序列最相近祖先的種屬信息,。根據(jù)silva數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列對(duì)OTU進(jìn)行種屬鑒定,。（5）菌群群落結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)菌群分類學(xué)分析比對(duì)結(jié)果,，對(duì)樣本群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行菌群種類和豐度分析,。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用ABI實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）對(duì)腸道中最常見的細(xì)菌分別進(jìn)行定量檢測(cè)。PCR均采用25 μL反應(yīng)體系,，包括2×PCR Mix,、2 U Taq DNA聚合酶、0.2 mmol/L dNTP,、正向和反向引物各0.1 μmol/L以及 5 μL DNA模板,。反應(yīng)程序：95 ℃1 min,；95 ℃ 25 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s,，40個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR均以濃度101～108拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)菌種16S rRNA基因片段的質(zhì)粒DNA構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,，用每克糞便16S rRNA基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值表示2個(gè)組別所有個(gè)體細(xì)菌數(shù)量,。樣本定量數(shù)據(jù)經(jīng)log10轉(zhuǎn)換后錄入SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。PCR引物序列見表1,。

三,、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。一般計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn),，組間和組內(nèi)相似性系數(shù)等計(jì)量資料結(jié)果以±s表示,，進(jìn)行t檢驗(yàn)，Dice相似性系數(shù)采用UPG-MA方法計(jì)算,。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列

菌種 引物序列 產(chǎn)物序列長(zhǎng)度（bp）擬桿菌門 F: CATGTGGTTTAATTCGATGAT 126 R: AGCTGACGACAACCATGCAG厚壁菌門 F: ATGTGGTTTAATTCGAAGCA 126 R: AGCTGACGACAACCATGCAC放線菌門 F: CGCGGCCTATCAGCTTGTTG 600 R: CCGTACTCCCCAGGCGGGG變形桿菌門 F: CATGACGTTACCCGCAGAAGAAG 195 R: CTCTACGAGACTCAAGCTTGC梭形桿菌門 F: CCCTTCAGTGCCGCAGT 273 R: GTCGCAGGATGTCAAGAC擬桿菌屬 F: GAGAGGAAGGTCCCCCAC 106 R: CGCTACTTGGCTGGTTCAG普雷沃菌屬 F: GGTTCTGAGAGGAAGGTCCCC 121 R: TCCTGCACGCTACTTGGCTGⅣ型梭菌屬 F: GCACAAGCAGTGGAGT 239 R: CTTCCTCCGTTTTGTCAA乳桿菌屬 F: GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC 126 R: GGCCAGTTACTACCTCTATCCTTCTTC韋榮球菌屬 F: ACCAACCTGCCCTTCAGA 343 R: CGTCCCGATTAACAGAGCTT Blautia球菌-直腸真桿菌屬 F: CGGTACCTGACTAAGAAGC 429 R: AGTTTCATTCTTGCGAACG雙歧桿菌屬 F: CTCCTGGAAACGGGTGG 550 R: GGTGTTCTTCCCGATATCTACA

結(jié) 果

一、研究對(duì)象的一般情況

通過問卷調(diào)查發(fā)現(xiàn),，研究組和對(duì)照組間飲食習(xí)慣及戶外鍛煉情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,。除空腹血糖、糖化血紅蛋白及空腹胰島素水平2個(gè)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）外,，其他指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,。見表2。

二,、菌群群落結(jié)構(gòu)分析

通過序列分析,，在菌門水平上研究組和對(duì)照組樣本主要包含5個(gè)菌門,，其中厚壁菌門與擬桿菌門之和約占90%，變形桿菌門,、放線菌門和梭形桿菌門各占1%～5%,。擬桿菌門的序列主要是擬桿菌綱，厚壁菌門的序列主要是梭菌綱,，其他還有產(chǎn)芽孢菌和芽孢桿菌,，分別占所有序列的7%和2%。

樣本稀疏曲線是統(tǒng)計(jì)研究對(duì)象所代表的物種數(shù)目,，并以個(gè)體數(shù)和物種數(shù)來構(gòu)建的曲線,，其可以用來比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理,。本研究樣本的稀疏曲線見圖1,，在序列數(shù)＜2 000條時(shí)，樣本稀疏指數(shù)隨序列數(shù)增加而迅速增加,，在序列數(shù)＞6 000條時(shí),，樣本稀疏指數(shù)增加緩慢之后則進(jìn)入平臺(tái)期。大部分樣本的稀疏曲線趨于平緩,，這表示樣本中大部分的物種都被檢測(cè)到,。對(duì)照組樣本稀疏指數(shù)范圍為52～221，而研究組樣本稀疏指數(shù)范圍為47～162,。

三,、腸道菌群豐度及多樣性分析

通過16S rRNA-V3區(qū)的深度測(cè)序，經(jīng)97%相似性歸并后研究組和對(duì)照組的測(cè)序覆蓋深度（Coverage指數(shù)）＞0.99,。對(duì)照組患者Reads指數(shù)（23 454.33±2 224.89）略高于研究組（22 921.45± 1 258.76）,，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.057 6）。2個(gè)組研究對(duì)象所獲得的OTU差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 0）,。Ace或Chao1越大說明菌群豐度越高,，對(duì)照組的Ace和Chao1分別是（209.77±32.21）和（225.54±43.55），而研究組分別為（119.09±24.91）和（187.49±36.42）,，2個(gè)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,。Shannon越大或Simpson越小表明群落多樣性越強(qiáng)，對(duì)照組Shannon和Simpson分別為（3.23±0.89）和（0.088 7±0.050 1）,，研究組分別為（2.39±0.76）和（0.128 7±0.071 2）,，2個(gè)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組Shannon范圍為2.71～4.09,，而研究組Shannon范圍為1.32～3.65,。見表3、圖2。

表2 研究對(duì)象的基本資料

注：BMI為體重指數(shù)（body mass index）

組別 年齡（歲）性別（男/女）BMI（kg/m2）空腹血糖（mmol/L）糖化血紅蛋白（%）空腹胰島素（mU/L）甘油三酯（mmol/L）總膽固醇（mmol/L）對(duì)照組 52.11±8.56 11/10 30.95±2.77 12.16±3.13 10.71±2.31 15.26±6.17 2.13±1.32 5.39±1.32研究組 48.12±9.33 13/8 31.23±2.91 5.29±1.19 4.22±1.23 9.35±3.09 2.09±1.38 5.53±1.21 P值 0.16 0.49 0.75 0.00 0.00 0.00 0.92 0.73

圖1 研究樣本的稀疏曲線

四,、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn),，在門水平，研究組的厚壁菌門,、擬桿菌門及放線菌門與對(duì)照組比較,，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,，而變形桿菌門和梭形桿菌門差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,。研究組的厚壁菌門和放線菌門較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05），而擬桿菌門顯著上升（P=0.00）,。同時(shí),，研究組厚壁菌門/擬桿菌門比值顯著下降（P=0.00）。見表4,。

在厚壁菌門中,，研究組的韋榮球菌屬和Ⅳ型梭菌屬較對(duì)照組顯著上升（P=0.00），而乳桿菌屬和Blautia球菌-直腸真桿菌屬則顯著下降（P＜0.05）,。在擬桿菌門中,，研究組的擬桿菌屬較對(duì)照組顯著上升（P=0.00），而普雷沃菌屬則顯著下降（P=0.01）,。在放線菌門中,，研究組的雙歧桿菌屬較對(duì)照組顯著下降（P=0.00）。見表5,。

表 3 研究組和對(duì)照組菌群的豐度及多樣性比較

組別 Reads指數(shù) Coverage指數(shù) OTU Ace Chao1 Shannon Simpson對(duì)照組 23 454.33±2 224.890.998 1±0.002 1188.12±19.16 209.77±32.21 225.54±43.55 3.23±0.89 0.088 7±0.050 1研究組 22 921.45±1 258.760.997 2±0.001 8113.44±17.25 119.09±24.91 187.49±36.42 2.39±0.76 0.128 7±0.071 2 P值 0.057 6 0.143 8 0.000 0 0.000 0 0.003 8 0.002 1 0.041 5

圖2 研究樣本的Shannon曲線

表4 研究組和對(duì)照組腸道菌群門水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果比較

組別 擬桿菌門 厚壁菌門 放線菌門 變形桿菌門 梭形桿菌門 厚壁菌門/擬桿菌門比值對(duì)照組 9.12±1.71 13.21±1.22 7.11±1.50 8.23±1.67 7.32±1.55 1.42±0.31研究組 10.87±1.84 11.97±1.13 5.98±1.43 8.51±1.81 7.47±1.58 1.12±0.23 P值 0.00 0.00 0.02 0.60 0.76 0.00

表5 研究組和對(duì)照組腸道菌群屬水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果比較

組別 擬桿菌屬 普雷沃菌屬 Ⅳ型梭菌屬 乳桿菌屬 韋榮球菌屬 Blautia球菌-直腸真桿菌屬 雙歧桿菌屬對(duì)照組 7.95±0.74 7.19±1.21 6.12±0.83 5.11±0.42 5.81±0.61 7.01±0.66 7.11±1.01研究組 9.21±0.66 6.23±1.13 7.59±0.64 4.19±0.37 8.91±0.78 6.32±0.91 4.81±0.83 P值 0.00 0.01 0.00 0.00 0.00 0.01 0.00

討 論

近年來,，有研究認(rèn)為腸道菌群的改變與包括肥胖、糖尿病等代謝性疾病及心血管疾病的發(fā)生有關(guān)聯(lián)［2］,。利用高通量測(cè)序技術(shù)研究腸道菌群能夠克服常規(guī)培養(yǎng)方法的缺陷,，發(fā)現(xiàn)低豐度細(xì)菌或未知細(xì)菌，進(jìn)而可全面,、準(zhǔn)確地獲得菌群的信息,。國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)2型糖尿病患者的腸道菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腸道菌群的種類和數(shù)量與正常人存在差異［5-6］,。然而肥胖作為2型糖尿病的一個(gè)重要環(huán)境因素,，上述研究并未對(duì)其進(jìn)行考量和分析。因此,，對(duì)患2型糖尿病的肥胖人群體內(nèi)腸道菌群進(jìn)行分析有一定的臨床意義,。

從腸道菌群群落豐度和結(jié)構(gòu)上看，本研究對(duì)照組腸道菌群豐度和多樣性均高于研究組,。腸道菌群豐度和結(jié)構(gòu)可代表消化道菌群的基本狀況,，本研究結(jié)果說明對(duì)照組腸道菌群的物種總數(shù)高于研究組。在一項(xiàng)大樣本研究中，研究者利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)人類腸道菌群進(jìn)行分析,，認(rèn)為腸道菌群基因豐度可作為代謝性疾病的標(biāo)志物［7］,。該研究發(fā)現(xiàn)人群腸道細(xì)菌基因數(shù)分布呈雙峰樣，特別是在肥胖人群中雙峰分布明顯,，而正常對(duì)照呈單峰樣,。我們推測(cè)“雙峰”可能代表了不同的人群，正如本研究中研究組人群代表了“低豐度”人群,，而對(duì)照組人群代表了“高豐度”人群,。COTILLARD等［8］也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，他們同時(shí)通過飲食干預(yù)對(duì)低豐度人群進(jìn)行了干預(yù),，結(jié)果顯示豐度的提高伴隨著代謝紊亂的改善,。這些研究成果為患2型糖尿病的肥胖人群的臨床治療打開了一扇窗。

在初步了解研究對(duì)象腸道菌群的豐度和結(jié)構(gòu)后,，本研究進(jìn)一步對(duì)腸道菌群的種群進(jìn)行了分析,。人類腸道菌群種類繁多，從門的水平上可分為5大類,，包括厚壁菌門,、擬桿菌門、變形桿菌門,、放線菌門和梭形桿菌門,，其中約90%由厚壁菌門和擬桿菌門構(gòu)成。本研究結(jié)果顯示,，厚壁菌門和擬桿菌門是2組人群腸道中的主要菌群,，只是在構(gòu)成比上存在差異。定量分析結(jié)果顯示,，研究組擬桿菌門顯著上升而厚壁菌門顯著下降,。在腸道菌群中，厚壁菌門和擬桿菌門比例的不平衡與許多疾病相關(guān),。有研究認(rèn)為肥胖人群厚壁菌門占優(yōu)勢(shì),，厚壁菌門/擬桿菌門比值較高［1］；也有研究認(rèn)為糖尿病患者擬桿菌門占優(yōu)勢(shì),，而厚壁菌門/擬桿菌門比值較低［9］,。上述研究顯示單純肥胖者和糖尿病患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異，而本研究結(jié)果顯示患2型糖尿病的肥胖人群似乎更傾向于糖尿病患者的腸道菌群特點(diǎn),。同時(shí),，本研究還發(fā)現(xiàn)放線菌門在2個(gè)組間也有差異（P=0.02）。

以往研究顯示,，腸道菌群可促進(jìn)蛋白質(zhì),、糖類等物質(zhì)的吸收,，把難吸收的多糖轉(zhuǎn)變?yōu)閱翁牵瑓⑴c膽固醇的代謝等,，對(duì)腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝具有重要的干預(yù)作用［2,，10］。我們通過文獻(xiàn)檢索,，對(duì)7個(gè)目標(biāo)菌種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行分析,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在研究組中擬桿菌屬、Ⅳ型梭菌屬和韋榮球菌屬顯著上升,，而乳桿菌屬,、雙歧桿菌屬、Blautia球菌-直腸真桿菌屬和普雷沃菌屬則顯著下降,。乳桿菌屬和雙歧桿菌屬能產(chǎn)生乳酸,，具有益生菌的特點(diǎn),。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,，高水平的乳桿菌屬和雙歧桿菌屬具有抵抗糖尿病的作用，而擬桿菌屬和Ⅳ型梭菌屬能促進(jìn)糖尿病的形成［11］,。細(xì)菌產(chǎn)生的乳酸能被腸道內(nèi)另一類產(chǎn)丁酸的細(xì)菌利用,，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成丁酸［12］，丁酸能促進(jìn)腸道合成黏蛋白,，保護(hù)腸黏膜的完整性,。Blautia球菌-直腸真桿菌屬是一個(gè)主要的產(chǎn)丁酸菌種，而普雷沃菌屬的作用主要是降解黏蛋白,。擬桿菌屬,、Ⅳ型梭菌屬和韋榮球菌屬可以利用葡萄糖和乳酸最后分解成短鏈脂肪酸［13］，但是這些短鏈脂肪酸并不能合成黏蛋白,，反而能導(dǎo)致腸道黏膜的通透性增加,，促進(jìn)炎癥的形成［12］。這些對(duì)特定菌種的研究成果為我們利用腸道菌群靶向治療2型糖尿病奠定了基礎(chǔ),。

肥胖是2型糖尿病的高危因素,，本研究通過對(duì)患2型糖尿病的肥胖人群的腸道菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了在此類人群中腸道菌群的一些特異性變化,，為預(yù)防和臨床治療2型糖尿病拓展了視野,。然而，本研究雖然考慮了飲食及體育鍛煉等因素,，但腸道菌群還受年齡,、地域等因素影響，因此多中心,、大樣本的研究是非常有意義的,，同時(shí)腸道菌群變化與2型糖尿病的因果關(guān)系還需進(jìn)一步探索,。

參考文獻(xiàn)

［1］LEY RE，TURNBAUGH PJ,，KLEIN S,，et al. Microbial ecology：human gut microbes associated with obesity［J］. Nature，2006,，444（7122）：1022-1023.·

［2］ TREMAROLI V,，BACKHED F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism［J］. Nature，2012,，489（7415）：242-249.

［3］EREJUWA OO,，SULAIMAN SA，AB WAHAB MS. Modulation of gut microbiota in the management of metabolic disorders：the prospects and challenges［J］. Int J Mol Sci,，2014,，15（3）：4158-4188.

［4］HOTAMISLIGIL GS. Inflammation and metabolic disorders［J］. Nature，2006,，444（7121）：860-867.

［5］QIN J,，LI Y，CAI Z,，et al. A metagenomewide association study of gut microbiota in type 2 diabetes［J］. Nature,，2012，490（7418）：55-60.

［6］KARLSSON FH,，TREMAROLI V,，NOOKAEW I，et al. Gut metagenome in European women with normal,，impaired and diabetic glucose control［J］. Nature,，2013，498（7452）：99-103.

［7］LE CHATELIER E,，NIELSEN T,，QIN J，et al. Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers［J］. Nature,，2013,，500（7464）：541-546.

［8］COTILLARD A，KENNEDY SP,，KONG LC,，et al. Dietary intervention impact on gut microbial gene richness［J］. Nature，2013,，500（7464）：585-588.

［9］FURET JP,，KONG LC，TAP J,，et al. Differential adaptation of human gut microbiota to bariatric surgery-induced weight loss：links with metabolic and low-grade inflammation markers［J］. Diabetes,，2010,，59（12）：3049-3057.

［10］TONUCCI LB，OLBRICH DOS SANTOS KM,，LICURSI DE OLIVEIRA L,，et al. Clinical application of probiotics in type 2 diabetes mellitus：a randomized，double-blind,，placebo-controlled study［J］. Clin Nutr,，2015. ［Epub ahead of print］

［11］ROESCH LF，CASELLA G,，SIMELL O,，et al. Influence of fecal sample storage on bacterial community diversity［J］. Open Microbiol J，2009,，3：40-46.

［12］BROWN CT,，DAVIS-RICHARDSON AG，GIONGO A,，et al. Gut microbiome metagenomics analysis suggests a functional model for the development of autoimmunity for type 1 diabetes［J］. PLoS One,，2011，6（10）：e25792.

［13］BURGER-VAN PAASSEN N,，VINCENT A,，PUIMAN PJ,，et al.The regulation of intestinal mucin MUC2 expression by short-chain fatty acids：implications for epithelial protection［J］. Biochem J,，2009，420（2）：211-219.

（本文編輯：姜 敏）

Analysis of gut microbiota in obese population with type 2 diabetes mellitus

ZENG Yipeng1,，HU Yan2,，WU Ping2，F(xiàn)ENG Xin'ge1,，GU Chengying1,，GUO Yafang1.
（1. Department of Traditional Chinese Medicine，Shanghai Pudong Hospital,，Shanghai 201399,，China；2. Department of Clinical Laboratory,，Shanghai Pudong Hospital,，Shanghai 201399，China）

Abstract：Objective To investigate the characteristics of gut microbiota in obese population with type 2 diabetes mellitus. Methods A total of 21 obese patients with type 2 diabetes mellitus（study group） and 21 obese subjects with normal glucose（control group） were enrolled. The fecal samples were collected and determined by Illumina Miseq high-throughput sequencing for the V3 region of 16S rRNA gene. The abundance and distribution were analyzed by cluster analysis. Gut microbiota was analyzed by real-time quantitation polymerase chain reaction（PCR）. Results The analysis of DNA sequence was successfully performed. The rare faction curves showed that adequate sequencing depth was achieved,，and the coverage indices were ＞0.99. The Ace and Chao1 indices of study group were lower than those of control group（P＜0.05）. The Shannon index or Simpson index of study group was lower or higher than that of control group（P＜0.05）. The results of real-time quantitation PCR showed that the quantities of Actinobacteria and Firmicutes were lower（P＜0.05）,，while that of Βacteroidetes was higher in study group than that in control group（P＜0.05）. The quantities of Proteobacteria and Fusobacteria had no statistical significance between the 2 groups（P＞0.05）. The quantities of Veillonella，Clostridium Ⅳ and Βacteroides were higher,，and the quantities of Lactobacillus,，Βlautia coccoides-Eubacterium rectale,，Prevotella and Βifidobacterium were lower in study group compared with those in control group（P＜0.05）. Conclusions The obese population with type 2 diabetes mellitus has low abundance and diversity of gut microbiota. The quantitation analysis of the composition of gut microbiota has a certain significance.

Key words：Gut microbiota；Type 2 diabetes mellitus,；Obese,；High-throughput sequencing

文章編號(hào)：1673-8640（2016）010-0848-06

中圖分類號(hào)：R446. 5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.010.003

基金項(xiàng)目：上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金項(xiàng)目（PKJ2012-Y20）

作者簡(jiǎn)介：曾藝鵬，男,，1971年生,，碩士，副主任醫(yī)師,，主要從事糖尿病致病機(jī)制研究,。

收稿日期：（2016-03-24）