·綜 述·

陳 軼1,，沈曉燕2**

（南通大學(xué)1醫(yī)學(xué)院,，2電子信息學(xué)院，江蘇226001）

[摘 要] 獲得有效的脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路模型是脊髓損傷診療取得成功的關(guān)鍵因素之一,。隨著生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)的不斷發(fā)展,，已有多種神經(jīng)示蹤技術(shù)用于測定脊髓神經(jīng)的傳導(dǎo)通路。脊髓神經(jīng)纖維分布密集,，傳導(dǎo)通路復(fù)雜,，建立完善的脊髓神經(jīng)通路模型仍是目前需解決的核心課題。本文系統(tǒng)闡述近年脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路的測定方法的研究進展,，并對未來發(fā)展方向進行討論和展望,。

[關(guān)鍵詞] 脊髓神經(jīng)；傳導(dǎo)通路,；神經(jīng)示蹤,；脊髓損傷

從嚴格的解剖學(xué)角度來看，脊椎動物的脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜,，大腦運動指令輸出以及周圍神經(jīng)信息的上傳都需要通過脊髓神經(jīng)完成,。脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路一般由多個神經(jīng)元組成，用于傳導(dǎo)某種特定的信息連接,，如運動的沖動,、痛覺、視覺等,。按信息的傳導(dǎo)方向可把神經(jīng)通路分為上行性和下行性兩種,。前者主要是向高位中樞包括大腦皮層輸入感覺信息，后者主要是傳遞控制軀體及內(nèi)臟運動的信息,，如軀體運動是神經(jīng)通路計算運動指令和性能后的行為輸出,，物理切斷產(chǎn)生和調(diào)節(jié)軀體運動的脊髓神經(jīng)下行傳導(dǎo)通路會對運動控制造成直接和毀滅性的影響[1-2]。脊髓損傷后功能重建的重要挑戰(zhàn)之一就是測定脊髓神經(jīng)損傷前后的傳導(dǎo)通路,。因此,，本文就脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路測定方法的應(yīng)用進展作簡要綜述。

1 單一方法測定脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路

1.1 生物素葡糖聚胺 （biotinylated dextran amine,，BDA） BDA是一種長傳導(dǎo)束細微終末結(jié)構(gòu)的順行,、逆行示蹤劑，由Glover等[3]于1986年首次使用在神經(jīng)束追蹤實驗中,。BDA在細胞外注射后被神經(jīng)元吸收,，沿軸突轉(zhuǎn)運至遠處，然后將神經(jīng)組織標(biāo)本經(jīng)ABC免疫組化染色,，用抗生物素蛋白與標(biāo)記物中的生物素反應(yīng)，最終經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺顯影,，顯示標(biāo)記區(qū)域的神經(jīng)走向,。由于BDA使用方便、標(biāo)記充分、靈敏度高,，因此廣泛用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域,。

針灸在中醫(yī)臨床中有著廣泛使用，但其治療疾病的具體機理還尚未完全闡明,。對穴位區(qū)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間神經(jīng)傳導(dǎo)通路進行測定將有助于從神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的角度闡釋針灸的機理,。和鳳軍等[4]將BDA分別注射在大鼠大椎穴和第6、7頸椎棘突之間,，觀察到大椎穴和周圍非穴位區(qū)神經(jīng)傳導(dǎo)通路在脊髓上頸節(jié)段存在相似性,，證明BDA是穴位神經(jīng)傳導(dǎo)通路的可靠示蹤劑，同時為大椎穴治療疾病與神經(jīng)調(diào)節(jié)相關(guān)性提供形態(tài)學(xué)依據(jù),。Liang等[5]在對小鼠脊髓中髓束纖維分布情況的研究中,，將BDA注入中縫蒼白核（RPa）和中縫隱核（Rob）中，發(fā)現(xiàn)源自后腦中縫和網(wǎng)狀核的5-羥色胺能纖維和非5-羥色胺能纖維在小鼠脊髓有相似的終止模式,。

此外,，楊偉東等[6]在脊髓損傷大鼠模型中研究脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路改變情況時，采用BDA作為逆行試劑注射在大鼠膀胱壁,，成功觀察到大鼠背側(cè)胸腰段脊髓損傷后不同時間段膀胱排尿神經(jīng)傳導(dǎo)通路在脊髓中的變化,。Kathe等[7]也將其用于測定大鼠單側(cè)錐體束損傷模型的運動神經(jīng)傳導(dǎo)通路。

1.2 霍亂毒素B亞單位生物素偶聯(lián)物（biotin conjugates of cholera toxin B subunit,，b-CTB） CTB作為一種常規(guī)的細菌毒素可以通過受體GM1與細胞表面結(jié)合,，經(jīng)神經(jīng)末梢或切斷的軸突主動攝取進入軸突或樹突，廣泛用于神經(jīng)科學(xué)研究中[8-9],。雖然CTB靈敏性高,，但是缺乏跨神經(jīng)元追蹤的能力，常用于研究單突觸映射,。為了將CTB應(yīng)用到跨神經(jīng)元傳導(dǎo)追蹤中,，Lai等[10]采用CTB的生物素偶聯(lián)物b-CTB注射到坐骨神經(jīng)，實驗證明b-CTB能夠很好地對大鼠脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路進行跨神經(jīng)元追蹤,，原因可能在于CTB與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂之間和生物素與其受體之間特殊的相互作用,。b-CTB能追蹤一級神經(jīng)元、二級神經(jīng)元,，甚至更遠的神經(jīng)元,，并且能夠在光鏡和電鏡水平下觀察，進一步推進脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路的測定,。

1.3 熒光金（fluorescein gold,，F(xiàn)G） FG是一種強效的神經(jīng)逆行熒光示蹤劑，其靈敏度高,，結(jié)果穩(wěn)定[11],，不會在非特異性結(jié)合傳代中未損傷的纖維,，也不會滲出標(biāo)記的神經(jīng)元。譚龍旺等[12]選用FG標(biāo)記脊髓損傷模型大鼠用以電針聯(lián)合嗅鞘細胞移植方案在治理脊髓損傷過程中脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路的改變情況,。但是,，傳統(tǒng)的FG存在一定的神經(jīng)毒性且使用劑量較多，會導(dǎo)致注射位置組織損傷并引起運動功能障礙,。為此,，Mondello等[13]使用TritonTM，在提高神經(jīng)系統(tǒng)中FG吸收能力的同時,，減少使用劑量,，大幅度降低FG造成的運動功能障礙。

1.4 偽狂犬病毒 （pseudorabies virus,，PRV） PRV作為一種用于神經(jīng)通路解剖追蹤的嗜神經(jīng)型α-皰疹病毒,，能跨突觸感染相連的神經(jīng)元[14]。因PRV不會感染人而備受神經(jīng)科學(xué)家重視,。孟稱心[15]在測定大鼠脊髓髓胸腰椎背側(cè)和外側(cè)損傷對排尿中樞神經(jīng)通路的改變情況時采用PRV示蹤技術(shù),。Dobberfuhl等[16]利用PRV探究雄性大鼠參與提肛肌和球海綿體肌的神經(jīng)元在脊髓中的分布位置和數(shù)量，結(jié)果顯示PRV標(biāo)記的運動神經(jīng)元分布在脊髓T11-S1節(jié)段,。與成年大鼠相比,，青春期前大鼠有更多的PRV標(biāo)記神經(jīng)元在脊髓L5-S1節(jié)段，這些節(jié)段主要是運動神經(jīng)元的分布區(qū)域,。

為了更加清晰地顯示神經(jīng)通路的傳導(dǎo)情況,，Ye等[17]采用基因重組PRV減毒株P(guān)RV-614探究胃神經(jīng)在脊髓組織中的傳導(dǎo)通路情況。PRV-614是一種會表達紅色熒光蛋白（RFP）的偽狂犬病毒,。實驗觀測到PRV-614陽性神經(jīng)元在胸椎和高位腰椎的雙側(cè)交感神經(jīng)區(qū)的分布情況,，進一步提供了小鼠胃與脊髓外側(cè)細胞柱之間神經(jīng)解通路的形態(tài)學(xué)證據(jù)。為探究腎臟功能相關(guān)神經(jīng)在脊髓中的解剖分布,，葉達偉[18]將PRV-614注入成年雄性小鼠腎臟,，采用熒光免疫組化技術(shù)檢測了胸腰段脊髓PRV-614的免疫陽性表達，同時測定腎臟與脊髓之間外側(cè)細胞柱（IML）神經(jīng)元之間的神經(jīng)通路,。

1.5 電刺激 （electrical stimulation,，ES） ES作為一種電生理學(xué)方法，釋放電壓引起脈沖電場激活傳入傳出神經(jīng)元,，直接激活受刺激神經(jīng)和反射反應(yīng)支配的肌肉[19],。該方法測定神經(jīng)傳導(dǎo)通路具有高度選擇性，并降低標(biāo)本制作過程中對神經(jīng)元形態(tài)造成的變動,，所得結(jié)果能很好地應(yīng)用于微電子橋接方案重建脊髓功能,，但神經(jīng)元同時檢測的數(shù)量受到限制。隨著電極工藝與生物信號處理技術(shù)的不斷進步,，ES已經(jīng)能很好地用于在體實驗,。沈曉燕等[20]利用ES技術(shù)探究控制后肢運動的脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路,。實驗方案如圖1所示,，將串脈沖刺激波形施加在大鼠腦皮層功能區(qū),，在誘發(fā)后肢運動的同時用記錄電極多點記錄同一脊髓橫截面神經(jīng)誘發(fā)電位信號，并選取信號幅值最大的位置為有效位點,。同理,，在其他脊髓橫截面進行檢測，并運用相關(guān)性分析方法驗證各個有效位點之間的相關(guān)程度及誘發(fā)電位的傳導(dǎo)速度,。

圖1 電刺激技術(shù)測定脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路原理圖

此外,，ES技術(shù)還能夠在動物清醒的狀態(tài)下完成神經(jīng)傳導(dǎo)通路的測定實驗，減少麻醉藥物對誘發(fā)電位的影響,，使實驗結(jié)果更接近真實活體情況,，這對神經(jīng)傳導(dǎo)通路及其特性的測定有著不同尋常的意義。Riddle等[21]將刺激電極植入左側(cè)錐體束（PT）和右內(nèi)側(cè)縱束（MLF）中,，記錄電極植入C6~C8用以研究獼猴在清醒狀態(tài)下錐體束和內(nèi)側(cè)腦干下行傳導(dǎo)束在脊髓中的分布情況,，發(fā)現(xiàn)它們在很大程度上存在重疊，其中包括參與手控制的傳導(dǎo)束,。

1.6 彌散張量成像 （diffusion tensor imaging,，DTI）DTI是一項在彌散加權(quán)成像基礎(chǔ)上優(yōu)化的新技術(shù)，利用水分子彌散方向和速率構(gòu)建脊髓白質(zhì)纖維的走向和形態(tài),，并且可以發(fā)現(xiàn)MRI無法顯示的早期病變[22],。DTI允許在活體無創(chuàng)情況下顯示神經(jīng)傳導(dǎo)通路，拓展了我們對皮質(zhì)脊髓束解剖學(xué)的知識,。Lee等[23]在研究頸脊髓壓迫癥導(dǎo)致的脊髓纖維束病變時使用了DTI技術(shù),，清晰地觀察到脊髓纖維束在頸脊髓壓迫癥患者與正常志愿者之間存在的差異。

1.7 雙光子成像 （two-photon imaging） 雙光子成像是一項結(jié)合激光掃描共聚焦成像和雙光子激發(fā)技術(shù)的顯微成像技術(shù),。雙光子顯微鏡具有對樣品光漂白區(qū)域小,，光毒性小，穿透能力強等優(yōu)點,，因此更適合在研究活體細胞組織中使用,，尤其是相對較厚的生物樣本。近年來,，雙光子成像也被用于脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路的研究[24-25],。雖然雙光子有較強的穿透能力，但是仍無法穿透脊椎骨,，因此,，Tang等[26]在觀察研究小鼠脊髓半橫斷損傷模型的脊髓神經(jīng)分布和走向時，通過制作植入式窗口固定裝置,，將小鼠需要成像的脊髓節(jié)段暴露在窗口下,，成功觀察到活體情況下脊髓半橫斷損傷后30min,、8h、24h,、48h時脊髓神經(jīng)分布和走向,。

2 復(fù)合方法測定脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路

不同的測定方法存在著不同的特點，其結(jié)果表現(xiàn)形式以及針對某一類神經(jīng)時往往會產(chǎn)生不同的效果,。脊髓神經(jīng)密集程度高且錯綜復(fù)雜,，任何細微的差別都會對通路的測定造成影響。因此,，為了提高脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路測定的可信度,，有必要將幾種測定方法綜合使用。

2.1 BDA聯(lián)合ES 在對普通狨猴控制前肢的皮質(zhì)脊髓束的神經(jīng)解剖特性進行研究時,，Kondo等[27]將BDA和電生理追蹤技術(shù)聯(lián)合使用,，利用BDA對C7節(jié)段的皮質(zhì)脊髓束軸突在腹外側(cè)索（VMF）、后側(cè)索（DLF）和后索（DC）中的傳導(dǎo)通路做了詳細分析,，并采用電生理技術(shù)對脊髓內(nèi)不同深度位點進行刺激與記錄,，測定了上行和下行神經(jīng)傳導(dǎo)通路并對其誘發(fā)電位傳導(dǎo)特性做了定量分析，結(jié)果顯示皮質(zhì)脊髓束雙邊投射比大鼠更為豐富,，但是皮質(zhì)運動神經(jīng)元與前肢運動神經(jīng)元之間并沒有直接連接,。

2.2 FG聯(lián)合BDA Liang等[28]在研究前庭外側(cè)核向脊髓投射的傳導(dǎo)通路時，將FG作為逆行標(biāo)記物注射在頸椎和腰椎節(jié)段右側(cè),，BDA作為順行標(biāo)記物標(biāo)記在前庭外側(cè)核,，實驗研究了前庭外側(cè)核的脊髓纖維分布格局，首次揭示了前庭外側(cè)核的神經(jīng)纖維終端,，并基于FG逆行追蹤結(jié)果劃定了前庭外側(cè)核與內(nèi)測核之間的邊界,，進一步提升了對前庭核系統(tǒng)的認識。

2.3 Fastblue聯(lián)合Fluoro-Ruby Capogrosso等[29]在研究通過腦—脊髓接口緩解獼猴脊髓損傷后的步態(tài)缺陷時,，將Fastblue和Fluoro-Ruby作為神經(jīng)示蹤劑分別注射到左右兩腿不同的肌肉中,，用以標(biāo)記脊髓中的運功神經(jīng)元，并利用Neurolucida軟件對脊髓連續(xù)切片進行3D重建,。重建結(jié)果以脊柱節(jié)段作為標(biāo)志建立統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫,，便于脊髓表面刺激電極的放置，實驗結(jié)果證明該脊髓運動神經(jīng)傳導(dǎo)通路測定方法能夠為實現(xiàn)獼猴重建運動功能提供更為實用的數(shù)據(jù),。

3 展 望

目前對脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路測定的研究主要集中在利用神經(jīng)示蹤劑,，通過神經(jīng)組織切片染色在光學(xué)顯微鏡水平下觀察。但在標(biāo)本制作過程中會發(fā)生形變,，使結(jié)果與動物活體狀態(tài)間存在較大差別,，不能良好反映脊髓神經(jīng)的真實傳導(dǎo)路徑。所以，今后的研究應(yīng)該建立更加真實的脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路數(shù)字化模型,。未來的改進方向主要有以下5點：（1）將電刺激技術(shù)與傳統(tǒng)生物學(xué)方法結(jié)合,。由于電刺激技術(shù)能夠很好地進行在體實驗，并記錄神經(jīng)傳導(dǎo)通路位點的數(shù)據(jù),，將其與生物學(xué)方法有機結(jié)合可以解決組織切片染色過程中造成的形態(tài)失真問題,，得到更為可信的脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路模型。（2）逆行,、順行示蹤劑同時用于同一個脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)通路測定,。（3）降低多種神經(jīng)通路測定方法同時使用造成的相互干擾，尤其是要探究電刺激對BDA,、CTB等示蹤劑造成的干擾，如試劑擴散,、性質(zhì)變異等,。（4）完善脊髓切片模型與活體之間的映射關(guān)系。（5）提升雙光子成像技術(shù)穿透組織的能力,合理利用組織透明化技術(shù),。為了達到這些目標(biāo)還需要科研人員繼續(xù)努力研究和創(chuàng)新,。

[參考文獻]

[1]Pivetta C，Esposito MS,，Sigrist MA.Motor-Circuit communication matrix from spinal cord to brainstem neurons revealed by developmental origin［J］.Cell,，2014，156（3）：537-548.

[2]Takeoka A,，Vollenweider I,，Courtine G，et al.Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury［J］.Cell,，2014,，159（7）：1626-1639.

[3]Glover JC，Petursdottir G,，Jansen JK.Fluorescent dextranamines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo［J］.J Neurosci Methods,，1986，18（3）：243-254.

[4]和鳳軍,，唐柱生,，吳冠儒，等.SD大鼠大椎穴BDA神經(jīng)通路示蹤研究［J］.中國民族民間醫(yī)藥,，2014（13）：38-39.

[5]Liang HZ,，Wang SS，F(xiàn)rancis R,，et al.Distribution of raphespinal fibers in the mouse spinal cord［J］.Mol Pain,，2015，11（1）：1-11.

[6]楊偉東,，雙衛(wèi)兵,，孟稱心,，等.BDA示蹤觀察脊髓胸腰段損傷后不同時間段膀胱排尿神經(jīng)通路的改變［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2014,，24（15）：15-19.

[7]Kathe C,，Hutson TH，Chen Q,，et al.Unilateral pyramidotomy of the corticospinal tract in rats for assessment of neuroplasticity-inducing therapies［J］.J Vis Exp,，2014 Dec15：（94）. doi：10.3791/51843.

[8]Shehab SA，Spike RC,，Todd AJ.Evidence against cholera toxin B subunit as a reliable tracer for sprouting of primary afferents following peripheral nerve injury［J］.Brain Res,，2003，964（2）：218-227.

[9]哈麗娟,，崔晶晶,，朱新龍，等.大鼠“涌泉”穴區(qū)相關(guān)神經(jīng)元及其纖維投射的節(jié)段和區(qū)域性分布——霍亂毒素亞單位B法［J］.針刺研究,，2013,，38（5）：375-379.

[10]Lai BQ，Qiu XC,，Zhang K,，et al.Cholera toxin B subunit shows transneuronal tracing after injection in an injured sciatic nerve［J］.PLoS One，2015,，10（12）：e0144030.

[11]Lanciego JL,，Wouterlood FG.A half century of experimental neuroanatomical tracing［J］.J Chem Neuroanat，2011,，42（3）：157-183.

[12]譚龍旺,，秦兆邦，朱峰,，等.電針聯(lián)合嗅鞘細胞移植對大鼠脊髓損傷神經(jīng)軸突再生及走向的影響［J］.中國骨傷,，2015，28（5）：441-445.

[13]Mondello SE,，Jefferson SC,，O’steen WA，et al.Enhancing fluorogold-based neural tract tracing［J］.J Neurosci Methods,，2016,，270：85-91.

[14]Card JP，Kobiler O,，Ludmir EB,，et al.A dual infection pseudorabies virus conditional reporter approach to identify projections to collateralized neurons in complex neural circuits［J］.PLoS One，2011，6（6）：e21141.

[15]孟稱心.外傷性背側(cè)及腹側(cè)脊髓損傷對排尿神經(jīng)通路改變的研究［D］.太原：山西醫(yī)科大學(xué),，2013.

[16]Dobberfuhl AD,，Oti T，Sakamoto H,，et al.Identification of CNS neurons innervating the levator Ani and ventral bulbospongiosus muscles in male rats［J］.J Sex Med,，2014，11（3）：664-677.

[17]Ye DW,，Liu C,，Tian XB，et al.Identification of neuroanatomic circuits from spinal cord to stomach in mouse：retrograde transneuronal viral tracing study［J］.Int J Clin Exp Pathol,，2014,，7（8）：5343-5347.

[18]葉達偉.調(diào)控小鼠腎臟功能的相關(guān)中樞核團神經(jīng)解剖學(xué)研究［D］.武漢：華中科技大學(xué)，2012.

[19]Popovic′DB.Advances in functional electrical stimulation（FES）［J］.J Electromyogr Kinesiol,，2014,，24（6）：795-802.

[20]沈曉燕，杜薇,，洪波.控制后肢運動的脊髓神經(jīng)信號追蹤方法研究［J］.高技術(shù)通訊，2015,，25（4）：393-396.

[21]Riddle CN,，Baker SN.Convergence of pyramidal and medial brain stem descending pathways onto macaque cervical spinal interneurons［J］.J Neurophysiol，2010,，103（5）：2821-2832.

[22]王琨,，郝強，沈洪興.彌散張量成像在脊髓型頸椎病中的應(yīng)用進展［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,，2014,，35（7）：780-785.

[23]Lee JW，Kim JH,，Park JB,，et al.Diffusion tensor imaging and fiber tractography in cervical compressive myelopathy：preliminary results［J］.Skeletal Radiol，2011,，40（12）：1543-1551.

[24]Laskowski CJ,，Bradke F.In vivo imaging：a dynamic imaging approach to study spinal cord regeneration［J］.Exp Neurol，2013,，242（4）：11-17.

[25]Fenrich KK,，Weber P，Hocine M,，et al.Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass Windows［J］.J Physiol,，2012，590（16）：3665-3675.

[26]Tang P，Zhang Y,，Chen C,，et al.In vivo two-photon imaging of axonal dieback，blood flow,，and Calci um influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury［J］.Sci Rep,，2015，5：9691.

[27]Kondo T,，Yoshihara Y,，Yoshino-Saito K，et al.Histological and electrophysiological analysis of the corticospinal pathway to forelimb motoneurons in common marmosets［J］. Neurosci Res,，2015,，98（9）：35-44.

[28]Liang H，Bácskai T,，Watson C,，et al.Projections from the lateral vestibular nucleus to the spinal cord in the mouse［J］.Brain Struct Funct，2014,，219（3）：805-815.

[29]Capogrosso M,，Milekovic T，Borton D,，et al.A brain-spine interface alleviating gait deficits after spinal cord injury in primates［J］.Nature,，2016，539（7628）：284-288.

[中圖分類號] TN91,；R318

[文獻標(biāo)志碼]B

[收稿日期] 2017-01-18

［文章編號］1006-2440（2017）01-0020-04

*[基金項目] 國家自然科學(xué)基金面上項目（81371663）,；國家自然科學(xué)基金重大項目（61534003）。

**[通信作者]沈曉燕,，E-mail：[email protected]