2012年的斑馬魚(yú)活體基因編輯是多么火啊,，當(dāng)時(shí)還特別去學(xué)習(xí)了一下,，做了以下的筆記。

分子生物學(xué)的基礎(chǔ)和興起離不開(kāi)各種酶的發(fā)現(xiàn)和抗體的制備,。沒(méi)有抗體,，蛋白質(zhì)就玩不轉(zhuǎn)，沒(méi)有限制性內(nèi)切酶和連接酶,，就沒(méi)有基因工程,，如果沒(méi)有耐高溫酶的發(fā)現(xiàn)，連PCR都是件痛苦的事情,，寫(xiě)到這里,，我突然覺(jué)得做細(xì)菌也是蠻好的，因?yàn)楸容^有可能發(fā)現(xiàn)一些功能比較奇特的蛋白,，而這些蛋白,，一經(jīng)改造，可能就是技術(shù)上的革新,。

TALE(transcription activator-like effector)也不例外,，最初在植物致病菌黃單胞菌（Xanthomonas）中被發(fā)現(xiàn)，在致病過(guò)程中,，能夠特異性地結(jié)合和調(diào)控植物基因,。

TALE的結(jié)構(gòu)中間 (紅色部分) 是重復(fù)序列，介導(dǎo)DNA識(shí)別,，每一個(gè)重復(fù)片段為33-35個(gè)氨基酸,，其中12和13位置兩個(gè)氨基酸決定堿基偏好性，這兩個(gè)相鄰的氨基酸被稱之為重復(fù)可變雙殘基（repeat variable di-residue, RVD）,，RVD所編碼的靶標(biāo)堿基由上圖b所示,，基本上你看一段TALE的重復(fù)序列，就可以預(yù)測(cè)到它將結(jié)合到什么樣的DNA序列上,，或者你看一段DNA序列,，可以很容易地設(shè)計(jì)結(jié)合它的TALE重復(fù)序列。

N端通常是288個(gè)殘基,，其中Δ152做為截?cái)帱c(diǎn),，去掉前面用于進(jìn)入植物細(xì)胞的功能，而保留TALE蛋白的其它功能,。C端通常是278個(gè)殘基,。

中間重復(fù)片段的特性使得TALE很容易被改造，應(yīng)用于各種定點(diǎn)靶向的場(chǎng)景,。

Activator

2011年發(fā)表在NBT上的文章《A TALE nuclease architecture for efficient genome editing》將TALE改造成促進(jìn)特定基因表達(dá),。將天然TALE進(jìn)行PCR擴(kuò)增，去掉前面152個(gè)殘基，重復(fù)序列改造為結(jié)合NTF3的啟動(dòng)子鄰近區(qū)域(proximal promoter),，C端連上VP16（轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域）,，結(jié)果誘導(dǎo)超過(guò)20倍的表達(dá)。NTF3基因編碼一個(gè)分泌性的生長(zhǎng)因子,，對(duì)神經(jīng)退行性疾病有一個(gè)的治療功效,。作者把C端截?cái)啵Ａ?5個(gè)殘基再接上VP16,，同樣也是mRNA超過(guò)20倍的表達(dá),。

Nuclease

位點(diǎn)特異性的核酸酶是基因組工程的有力工具，產(chǎn)生斷裂的雙鏈DNA（double strand breaks, DSBs）,，可以進(jìn)行同源重組,、靶向插入、刪除,。鋅指蛋白（zinc finger protein）連接FokI的水解結(jié)構(gòu)域,，構(gòu)成了鋅指核酶(zinc finger nuclease, ZFN)被用來(lái)進(jìn)行基因組編輯,，但是ZFN的特異性和效率較差,，可重復(fù)性不好。

TALE的單堿基識(shí)別能力,，顯然在特異性上是無(wú)可比擬的,，有了TALE，TALEN（TALE-nuclease,，TALE接上核酸酶）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生,，特異性好，效率高,，而且可以應(yīng)用于各種物種,。TALEN通常以同二聚體（homodimer）或異二聚體（hterodimer）對(duì)DNA從兩端進(jìn)行切割，兩端切割點(diǎn)的距離（spacer length）可以是10-30bp之間,，取決于linker的長(zhǎng)度,，即連接重復(fù)結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度，長(zhǎng)的linker,，需要長(zhǎng)的spacer,，反之亦然。

兩端切割后,，產(chǎn)生DSB,，就會(huì)引起系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，Miller等使用TALEN對(duì)NTF3基因進(jìn)行切割,，產(chǎn)生DSB,，隨后進(jìn)行非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）修復(fù)，NHEJ在沒(méi)有同源序列做為模版的情況下進(jìn)行修復(fù)，這是一個(gè)不精確的修復(fù)途徑,，結(jié)果產(chǎn)生了3-30bp的刪除,。

NHEJ是容易出錯(cuò)也不好控制的，可喜的是還存在一條精確可控的途徑,，同源依賴修復(fù)（homology dependent repair, HDR）,，在有供體ssDNA存在的情況下，通過(guò)HDR途徑,，可以對(duì)基因進(jìn)行編輯,，插入和缺失處理。

于是牛B的事情就產(chǎn)生了,，2012年Nature的文章報(bào)道在斑馬魚(yú)活體組織里使用TALEN技術(shù),，引入了定制的EcoRV位點(diǎn)和修改的loxP序列。

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