今天，華人科學(xué)家張鋒大神又刷屏了,。他和James Collins教授團(tuán)隊(duì),，聯(lián)合將CRISPR-Cas13a改造成了靈敏度達(dá)到了阿摩爾級(jí)（aM，10的負(fù)18次方摩爾每升）,，可以檢測(cè)單分子的SHERLOCK技術(shù),。這一重要成果刊登在今天的《科學(xué)》雜志上[1]。

James Collins教授（左）張鋒教授（右）

就在大家在為張鋒大神歡呼雀躍,，在為CRISPR-Cas13a叫好的時(shí)候,。我們發(fā)現(xiàn),，讓SHERLOCK技術(shù)達(dá)到阿摩爾級(jí)靈敏度的不是CRISPR-Cas13a，是它的搭檔,，另一個(gè)顛覆性的發(fā)明重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）,。很少有報(bào)道提起她,，她就那樣默默站在CRISPR-Cas13a背后,。

RPA有多厲害？據(jù)說(shuō)可以媲美PCR技術(shù)。什么是PCR,？著名發(fā)明家Kary Mullis因?yàn)榘l(fā)明這個(gè)技術(shù)于1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng)……據(jù)了解RPA技術(shù)是由英國(guó)科技公司TwistDx發(fā)明的,，發(fā)明人是Niall A. Armes和Derek L. Stemple。如果張鋒和Collins教授的這項(xiàng)發(fā)明最終能造福人類,，我們也應(yīng)該記住RPA的發(fā)明人。

接下來(lái)我們就看看RPA和CRISPR-Cas13a聯(lián)手,，如何鑄就SHERLOCK技術(shù)的,。

SHERLOCK與我們特別熟悉的CRISPR-Cas9有本質(zhì)上的區(qū)別，它使用的酶是Cas13a,。Cas9靶向切割的是DNA,，而Cas13a靶向的則是RNA；而且Cas13a是一個(gè)“奇怪而又瘋狂”的酶,，像Cas9在切割完特定片段后就會(huì)失活,，但Cas13a則會(huì)像“吃了炫邁一樣停不下來(lái)”，在切割了自己應(yīng)該切割的RNA后,，它還會(huì)繼續(xù)去切割其他遇到的RNA,。

其實(shí)在去年的6月份，張鋒教授就在《科學(xué)》雜志上介紹過(guò)這個(gè)可以在細(xì)菌細(xì)胞中切割特定RNA序列的“奇怪而又瘋狂”的酶了[2],。然而在面世僅僅三個(gè)月后,，另一位在CRISPR基因編輯系統(tǒng)領(lǐng)域做出卓越貢獻(xiàn)的“大神”就“找了個(gè)茬”，我想,，大家應(yīng)該已經(jīng)猜到了,，這位大神就是與張鋒教授有著專利之爭(zhēng)的，加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna教授,。

Jennifer Doudna教授

Doudna教授和她的同事在《自然》雜志上發(fā)表研究,，他們對(duì)Cas13a的潛力進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示,，如果想要讓Cas13a順利地與特定RNA結(jié)合,，樣本中至少需要數(shù)百萬(wàn)RNA分子，因此,，使用Cas13a其實(shí)是達(dá)不到許多基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用所需要的靈敏度的[3],。

這樣的CRISPR-Cas13a是不能被稱為“SHERLOCK”的,，那么張鋒教授是如何讓它“開掛般”提高靈敏度的呢？這還要感謝和張峰教授同在Broad研究所工作的,，合成生物學(xué)領(lǐng)域的“大?！薄狫ames Collins教授，他同時(shí)也是這次報(bào)告的聯(lián)合通訊作者,。兩位“大?！睌y手，他們想到了一個(gè)“外援”—— RPA,。

初始的Cas13a和“進(jìn)化”后的SHERLOCK靈敏度的對(duì)比

常規(guī)的PCR也可以擴(kuò)增特定DNA片段，提高靈敏度,，但是PCR對(duì)溫度的控制有很復(fù)雜的要求,，要經(jīng)歷高溫變性、低溫復(fù)性還有中溫延伸三個(gè)步驟,。RPA就不需要這么麻煩,，它的反應(yīng)需要三種在常溫下有活性的酶，最適溫度在37-42℃之間,，不需要變性過(guò)程,，這樣就大大加快了擴(kuò)增的速度。再加上不需要溫控設(shè)備,，兩者共同打造了真正便攜式的快速DNA擴(kuò)增技術(shù),。

不僅方便快捷，RPA更“迷人”的地方在于擴(kuò)增量十分高,，能夠?qū)⒑哿康暮怂幔ㄓ绕涫荄NA）模板擴(kuò)增到能夠可以檢測(cè)到的水平,。痕量，顧名思義就是“該物質(zhì)雖然存在,，但只有‘痕跡’,，無(wú)法用一般方法定量檢測(cè)，通常含量＜0.1mg”,，所以大家就知道RPA有多厲害了吧,？利用它可以從單分子得到大約10¹²的擴(kuò)增產(chǎn)物。而且RPA還不需要復(fù)雜的樣品處理,，及時(shí)環(huán)境限制,，無(wú)法提取核酸，也難不倒它[4],。

利用RPA,，在室溫中，樣品中DNA或RNA的含量就可以得到提升,，一旦含量增加了,，再將DNA轉(zhuǎn)化為RNA,。如此，Cas13a就有資格進(jìn)化成“SHERLOCK”了,！

不過(guò)SHERLOCK其實(shí)是一個(gè)“團(tuán)隊(duì)”,，研究人員給Cas13a“配備”了兩個(gè)助手：一個(gè)是引導(dǎo)它到達(dá)應(yīng)該被切割的特異性RNA的“向?qū)NA”；另一個(gè)叫做“報(bào)告RNA”,，因?yàn)镃as13a在切割完特定RNA后不會(huì)失活,，所以在Cas13a完成任務(wù)開始“作亂”的時(shí)候，報(bào)告RNA就會(huì)被切斷,，發(fā)出熒光信號(hào),。研究人員們就知道，它已經(jīng)找到了與其相匹配的RNA序列,。

SHERLOCK的工作原理

那么SHERLOCK現(xiàn)在能為我們做什么呢,？研究人員已經(jīng)證實(shí)，它可以應(yīng)用于多種疾病,，例如傳染病病原體的檢測(cè),、癌癥相關(guān)的基因突變的檢測(cè)。

在研究中,，他們用含有寨卡病毒和登革熱病毒的血樣進(jìn)行了測(cè)試,，結(jié)果顯示，即使病毒的滴度（即病毒的毒力）很低,，SHERLOCK還是能捕捉到,，而且對(duì)于類型很是相似的非洲寨卡病毒和美洲寨卡病毒，SHERLOCK也能準(zhǔn)確的分辨出它們的“身份”,。除了血液之外,，唾液和尿液也都可以“為SHERLOCK所用”。

使用SHERLOCK可以分辨出美洲寨卡病毒和非洲寨卡病毒,，兩種病毒株差異顯著

除了病毒的檢測(cè)外,，在大熱的癌癥液體活檢方面，SHERLOCK也顯示了一把它的身手,。在人體內(nèi),，每時(shí)每刻都有DNA片段進(jìn)入血液循環(huán)中，對(duì)于腫瘤患者來(lái)說(shuō)也不例外,，所以血液中也能檢測(cè)到與腫瘤有關(guān)的DNA片段,。但是腫瘤相關(guān)DNA的比例極低，因而檢測(cè)的難度也是很大的,。在研究人員的設(shè)計(jì)下,，他們用酶將DNA轉(zhuǎn)化為RNA，這樣SHERLOCK就可以靶定血液中的與腫瘤有關(guān)的突變了,！

研究人員以兩個(gè)基因突變?yōu)槔?，進(jìn)行了驗(yàn)證,，他們發(fā)現(xiàn)，即使突變的基因只占到基因組DNA的0.1%,，SHERLOCK還是能夠?qū)⑺鼈儥z測(cè)出來(lái),！這無(wú)疑會(huì)為液體活檢領(lǐng)域帶來(lái)不小的進(jìn)步。研究的第一作者Jonathan Gootenberg說(shuō)：“SHERLOCK對(duì)兩種類型的核酸（DNA和RNA）都很有用,，它真正的優(yōu)勢(shì)在于切割完特定片段之后還具有活性,，能夠觸發(fā)‘熒光報(bào)告’，讓我們知道,?！?/p>

除了這些之外，SHERLOCK還可以檢測(cè)人類基因組中的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP,，指基因組水平上單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列的多態(tài)性,，是人類可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種）、抗生素抗性基因,、區(qū)別包括大腸桿菌和銅綠假單胞菌在內(nèi)的5種特定類型的細(xì)菌，而且根據(jù)研究人員的介紹,，SHERLOCK甚至還可以區(qū)分肺炎球菌和桿菌不同的耐藥突變類型,！這些對(duì)于細(xì)菌感染患者的診斷、治療都有非常重大的意義,。

在人類基因組中,，SHERLOCK可以檢測(cè)出不同的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）

對(duì)于如此強(qiáng)大的SHERLOCK，曾經(jīng)“挑過(guò)刺兒”的Doudna教授表示,，“未來(lái)有很多疾病的檢測(cè)會(huì)應(yīng)用到SHERLOCK,，我們很高興看到他們的新成果建立在我們?cè)?jīng)提出的‘疾病檢測(cè)’的主意上，而且我們?cè)?jīng)的‘檢驗(yàn)工作’看起來(lái)對(duì)他們也非常有幫助,?！盵5]

目前，SHERLOCK在使用的時(shí)候可以將所需要的化學(xué)物質(zhì)放在一張玻璃纖維紙上,，在各種場(chǎng)景中使用,，而且每次的成本只需要61美分。研究人員認(rèn)為,，如此方便,、快捷的測(cè)試對(duì)于新傳染病爆發(fā)時(shí)的準(zhǔn)確檢測(cè)有著十分重大的意義，因?yàn)閭魅静∽铋_始出現(xiàn)的地方往往是一些環(huán)境較差的不發(fā)達(dá)國(guó)家,。

由于SHERLOCK廣泛的應(yīng)用范圍,，所以如何“商業(yè)化”也是研究人員很關(guān)心的一個(gè)問(wèn)題，Collins教授說(shuō),，他們目前正在積極的探索中,，很可能會(huì)成立一家公司來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo),。當(dāng)然了，商業(yè)化的SHERLOCK什么時(shí)候能夠正式進(jìn)入市場(chǎng),，這一切都還需要技術(shù)的繼續(xù)完善和FDA等機(jī)構(gòu)的監(jiān)督和認(rèn)可,。

參考文獻(xiàn)：

[1]Jonathan S. Gootenberg et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 2017 DOI:10.1126/science.aam9321

[2] Abudayyeh O O, Gootenberg J S, Konermann S, et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector[J]. Science, 2016, 353(6299): aaf5573.

[3] East-Seletsky A, O’Connell M R, Knight S C, et al. Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection[J]. Nature, 2016, 538(7624): 270-273.

[4] Piepenburg O, Williams C H, Armes N A, et al. Recombinase polymerase amplification: U.S. Patent 7,399,590[P]. 2008-7-15.

[5] http://www./news/2017/04/new-crispr-tool-can-detect-tiny-amounts-viruses