每一個(gè)做過分子克隆的人,，都會(huì)經(jīng)歷過對(duì)條帶,、對(duì)轉(zhuǎn)化子望眼欲穿的時(shí)刻，除了攢人品,，每一步的細(xì)節(jié)也很重要,。

通俗地說，很多人用了很多軟件設(shè)計(jì)來設(shè)計(jì)去,，又是考慮發(fā)夾結(jié)構(gòu),，又是考慮二聚體，又是考慮 Tm 值,，折騰來折騰去,，但其實(shí)沒那么復(fù)雜。

首先保證你要的基因是正確的,，這個(gè)可以從 NCBI 中找到,，大部分是沒問題的，然后再找到起始密碼子,，從那開始大概上游取 20~27 bp,，加上酶切位點(diǎn)，加上保護(hù)堿基（一般 3 個(gè)）就是上游引物,，取后 20~27 bp 堿基,，反向互補(bǔ)，加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基組成下游引物,。這樣引物設(shè)計(jì)就完成了,，可以放到軟件里看看 GC 含量，Tm 值,，發(fā)夾結(jié)構(gòu),，二聚體等，適當(dāng)調(diào)整堿基個(gè)數(shù)和保護(hù)堿基的個(gè)數(shù),。需要額外注意的是移碼問題,。

兩種方式：一種純化后直接酶切連接,；一種連 T 載體再往下酶切連接。我個(gè)人強(qiáng)烈建議第二種,，連 T 載體,。

PCR 產(chǎn)物直接酶切有兩個(gè)缺點(diǎn)：

• 由于兩頭把手太短，雖說有保護(hù)堿基,，但我覺得還是不如從質(zhì)粒上往下切好切,，而且容易切壞、切碎,。

• 無法從電泳上看出來切沒切開,，因?yàn)橐簿颓邢铝藥讉€(gè)或者十幾個(gè) bp，條帶沒啥變化,。

連 T 載體的優(yōu)點(diǎn)：

• 進(jìn)載體后,，大提一次的質(zhì)粒夸張點(diǎn)說夠用一輩子的,，再說 PCR 那東西還不太穩(wěn)定,，一把多一把少的。

• 酶切會(huì)很清晰,，切下來了就是有帶,，沒切動(dòng)就是沒有，沒連上也能知道不是沒切開而是別的步驟有問題,。

連 T 載體也有些麻煩的地方,，如需要的切點(diǎn)有時(shí)跟 T 載體上自帶的切點(diǎn)沖突，這就要小心鑒別,。而且連 T 載體最好測(cè)序看一下 PCR 的產(chǎn)物對(duì)不對(duì),、切點(diǎn)對(duì)不對(duì)?？傮w來講連 T 載體是很有優(yōu)勢(shì)的,。

總體來說，提質(zhì)粒問題不大,，都有試劑盒,，按照步驟來，沒啥大問題,。有時(shí)手工小提或粗提的質(zhì)粒酶切效果不好,，這可能是提取的不夠純或者內(nèi)切酶品質(zhì)不好。所以若酶切效果不佳建議用柱子精提或大提,。

用于連接的酶切很關(guān)鍵。需注意如下幾點(diǎn)：

• 如果是雙酶切 A 和 B,，預(yù)實(shí)驗(yàn)中必須做 A 和 B 各自的單酶切和 A+B 的雙酶切,，務(wù)必確認(rèn)這幾種酶都好用,，質(zhì)粒上的切點(diǎn)都好用。如果切不開就要考慮是不是酶的問題,，buffer 的問題,，質(zhì)粒上有沒有這些切點(diǎn)，序列是否甲基化等,。盡量選實(shí)驗(yàn)室常用的內(nèi)切酶,。

• 酶切盡量用大體系，如 50 uL,、100 uL 等,。大體系能稀釋內(nèi)切酶包裝中的甘油，對(duì)反應(yīng)有利,。相反,，連接盡量用小體系，以增加 DNA 末端的碰撞機(jī)會(huì),。

• 如果要回收,、連接，酶切用的 DNA 量不用太大,。大了會(huì)切碎,，形成一些不規(guī)則的末端，不利于連接,。

• 酶切后的電泳,，即切膠的那次電泳中，如果切成的條帶很清晰,，不拖泥帶水,，沒有彌散，沒有拖尾,，那做回收,、連接效果最好。相反,，若有彌散,、拖尾、不清楚,、一團(tuán)亮等情況就是切的不好,，做后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功率會(huì)降低。若真是效果很差建議改進(jìn)體系重新切,。

回收可以用柱式試劑盒或手工法,。

柱式回收試劑盒：此類試劑盒適合各種長度 DNA，對(duì)黏性末端基本沒有破壞，回收效率也不錯(cuò),。

手工醇沉淀法：步驟如下,，把切得的膠弄碎，用 Tris-HCl 浸泡一段時(shí)間,，吸出所有的液體,，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍,，加鹽和醇醇沉,，沉淀用 70％ 乙醇漂洗，再用 Tris 溶解,。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì) DNA 和黏性末端的損傷最小,，缺點(diǎn)是容易損失 DNA。若本來 DNA 數(shù)量就不多,，用手工法很容易丟失殆盡,。如果DNA 量很大可以考慮使用。

回收后要跑電泳,，一來估算回收液濃度,，二來看回收 DNA 的質(zhì)量。若條帶有彌散,，即自目的條帶以下有拖痕,，不是清晰利落的一條帶，則質(zhì)量不好,。因?yàn)闂l帶拖痕表示它已碎裂成比它小的各種長度的片段,，而主帶雖然還在那個(gè)位置但也已遭到一定程度的破壞。質(zhì)量不好的回收產(chǎn)物做連接成功率會(huì)降低,，假陽性克隆會(huì)增加,。造成回收質(zhì)量差的原因可能是回收這步，也可能是酶切那步,，如果酶切那步出現(xiàn)酶切中所描述的情況,，就容易造成回收質(zhì)量不好。只有回收到清晰,、利索的條帶,，才不影響連接。

做連接要求感受態(tài)的效率要高,。感受態(tài)的感受效率一般剛制備完時(shí)是最高的,，以后逐漸減弱，而且每次開－80℃冰箱,，溫度微升對(duì)感受態(tài)效率都有一定影響,，久而久之效率就不行了，這就要求大家取感受態(tài)時(shí)動(dòng)作迅速、最大程度減少感受態(tài)盒升溫,。

都知道感受態(tài)效率高好,，但麻煩的是感受態(tài)效率的高低不好通過實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)，因?yàn)槿敉ㄟ^轉(zhuǎn)質(zhì)粒來檢測(cè),，只要是效率中等的感受態(tài)都能長出很多克隆。所以如果你們的感受態(tài)已經(jīng)儲(chǔ)存了很長時(shí)間或者連接長的克隆連續(xù)幾把都太少就要重做感受態(tài)了,。

制備感受態(tài)不推薦新手直接去做,，最好由經(jīng)驗(yàn)豐富者做或他帶你做。用新做的感受態(tài)轉(zhuǎn)質(zhì)粒,，用同樣手法用量,，你會(huì)發(fā)現(xiàn)比舊感受態(tài)明顯多長很多克隆。此外可以考慮購買感受態(tài),。

最后才輪到連接,。連接的問題討論的是比較多的。如果前述若干步驟所得產(chǎn)物質(zhì)量好,，連接不會(huì)很難,。

• DNA 的量：DNA總量有幾十 ng 就能連接成。當(dāng)然如果你的 DNA 質(zhì)量好DNA 用量越大連接效率越高,。就怕你為了追求 DNA 數(shù)量而降低了質(zhì)量,，那可就得不償失了。

• vector 和 insert 的比例：如果 insert 不長（2 kb 以下）,、vector 是 insert的幾倍長,，可以用 1：3~1：9。如果 insert 較長（ 3~4 kb 以上）,、vector和 insert 長度相似或 insert 比 vector 還長,，可以用 1：1~1：3。短片段的連接相對(duì)容易,，做的好可以挑到好多正確的克隆,。長片段的連接效率較低，陽性克隆率小于等于 10％是很正常的,。我做過一個(gè)長片斷的連接,，6 k 的vector、6 k 的 insert,，比例用1：1,，挑了 20 個(gè)克隆有一個(gè)對(duì)。

• 體系體積：通常用 20 uL 都能連上,，若連長片段可以壓縮成 10 uL（前提是DNA 數(shù)量不變）,。我覺得體系不是很關(guān)鍵，有位很精通克隆的老師說他都用 50 uL 體系，照樣百發(fā)百中,。而且如果你的 DNA 是用 EB（即 Tris）溶解的,，體系中不加水也行。前述我自己連的長片段也是用 20 uL體系,，vector 和 insert 各上8 uL,。

• T4連接酶：酶這東西自然是越貴越好，一分錢一分貨,，而且連接酶控制著整個(gè)分子克隆過程的瓶頸——連接,，強(qiáng)烈建議買好的。如果連長片段就加二倍的連接酶,。

• 連接時(shí)間：過夜就應(yīng)該足夠了,，但是你要是不急著轉(zhuǎn)化，放到 4 度放幾天也行,，我個(gè)人認(rèn)為時(shí)間長只好不壞,。

• 連接溫度：最適是 16℃。有人用 PCR 儀造 16℃,，也有人用水浴鍋,。我用泡沫冰盒加涼水再添冰，用手感覺差不多十四五六度,，然后蓋蓋過夜,，基本上溫度不太變。你若感覺好不溫度,，拿個(gè)溫度計(jì)測(cè)也行,。有人用 4℃ 連接，也行,，我有時(shí)先16℃ 過夜,，再放 4℃ 里幾天。

• 轉(zhuǎn)化：連接的轉(zhuǎn)化不能像轉(zhuǎn)質(zhì)粒那么隨便,，要小心翼翼,，盡量作到不放棄任何一個(gè)菌。一般所用的感受態(tài)體積最少是連接體系的 5 倍,。長片段的連接轉(zhuǎn)化時(shí)搖菌 2 小時(shí),。

• 對(duì)照：對(duì)照很關(guān)鍵，可以反應(yīng)出很多重要的信息,，不要懶,，你的連接若是問題不少，就要乖乖的做對(duì)照,。一般有如下幾種對(duì)照方式：

• 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒對(duì)照,。和連接產(chǎn)物同樣抗性,、一起轉(zhuǎn)化、涂在同一個(gè)板上,。這個(gè)對(duì)照目的是檢測(cè)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是否有效,，即抗生素是否有效、板子是否有效,、轉(zhuǎn)化的手法是否正確,、以及感受態(tài)的效率如何（這需要你每次轉(zhuǎn)化質(zhì)粒都用相同的手法、用量,，看長的菌落數(shù),，若明顯太少就要懷疑感受態(tài)）。還有一個(gè)作用,，如果質(zhì)粒早就長出來了，都長挺大了你的連接產(chǎn)物還沒動(dòng)靜呢,，那八成是沒戲了,，別等了趕快去準(zhǔn)備下次連接的材料。

• 切完回收的 vector 直接轉(zhuǎn)化對(duì)照,。如果你是雙酶切,，切完的 vector 和沒切的 vector 的長度相差不大，或跑電泳這兩種跑不很開,，就要做這個(gè)對(duì)照,。目的是看切的是否徹底，是否還有環(huán)狀質(zhì)粒存在,。長不出克隆是對(duì)的,，若長出克隆，好好改進(jìn)你的酶切體系,。

• 切完回收的 vector 加連接酶自身連接再轉(zhuǎn)化做對(duì)照,。雙酶切的，最好要做這個(gè)對(duì)照,，而且這個(gè)對(duì)照長的克隆要挑若干提質(zhì)粒,。

  若切完的目的 vector和沒切的 vector 的長度相差較大，電泳條帶離的遠(yuǎn),，這個(gè)對(duì)照能檢測(cè)酶切和回收的質(zhì)量,。如果 DNA 末端遭破壞或斷裂，會(huì)隨機(jī)產(chǎn)生各種末端,，這些末端少數(shù)能連接到一起,，長度上小于等于回收的 vector。

  若切完的 vector 和沒切的 vector 的長度相差不大,，這個(gè)對(duì)照檢測(cè)是否有只進(jìn)行了單酶切的,?？傊婚L克隆或只長很少是對(duì)的，長多了還是去改進(jìn)上游的步驟,。

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