在表觀遺傳學(xué)中,DNA或組蛋白的共價(jià)修飾與基因的表達(dá)或沉默有關(guān),。為了改變DNA修飾,,研究人員過去曾使用組蛋白去乙酰酶等工具,但無法實(shí)現(xiàn)靶向的表觀遺傳修飾,。隨著基因組改造的浪潮來襲,,人們開始使用鋅指核酸酶和TALEN來實(shí)現(xiàn)表觀遺傳修飾。如今,,新工具CRISPR的出現(xiàn),,讓靶向修飾變得更容易。 激活 P300乙酰轉(zhuǎn)移酶 Charles Gersbach的實(shí)驗(yàn)室將催化功能區(qū)失活的Cas9(dCas9)與p300乙酰轉(zhuǎn)移酶的催化結(jié)構(gòu)域融合,,增加了啟動子和增強(qiáng)子區(qū)域的H3K27ac組蛋白修飾,。如今,他們已構(gòu)建出pcDNA-dCas9-p300 Core和pcDNA3.3-Nm-dCas9-p300 Core表達(dá)載體,。 Tet1脫甲基酶 Ronggui Hu的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建出pdCas9-Tet1-CD,,能夠?qū)Σ溉閯游锛?xì)胞進(jìn)行靶向胞嘧啶脫甲基化,。這個質(zhì)粒可與pcDNA3.1-MS2-Tet1-CD一起使用,,來減少甲基化,,并激活轉(zhuǎn)錄。Rudolf Jaenisch的實(shí)驗(yàn)室則提供這種修飾的慢病毒版本Fuw-dCas9-Tet1CD,。 抑制 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A Vlatka Zoldo?的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建出pdCas9-DNMT3A-EGFP和pdCas9-DNMT3A-PuroR,,可在哺乳動物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶向的胞嘧啶甲基化。共表達(dá)的標(biāo)志物EGFP和PuroR實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的選擇和分選,。Grant Challen的實(shí)驗(yàn)室也構(gòu)建出組成型(pCMV-dCas9-D3A)和Tet依賴型(TetO-dCas9-D3A)的載體,。對于慢病毒表達(dá),Rudolf Jaenisch實(shí)驗(yàn)室同樣提供Fuw-dCas9-Dnmt3a和Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP,。 為什么使用表觀遺傳修飾,?
當(dāng)然,,使用什么工具,,取決于您想要什么樣的結(jié)果。如果您想要研究一種特定修飾的效果,,那么表觀遺傳工具將是最好的選擇,。 此外,CRISPR工具的另一個潛在優(yōu)勢是它們的持久性和遺傳性,。由靶向修飾所留下的表觀遺傳標(biāo)記也許能更頻繁地被子細(xì)胞遺傳,。Stolzenburg等人曾比較了ZFN-KRAB 和ZFN-DNMT3A,發(fā)現(xiàn)KRAB誘導(dǎo)的沉默是短暫的,,可快速逆轉(zhuǎn),。然而,DNMT3A誘導(dǎo)的甲基化卻能持續(xù)存在100天,。 在某些情況下,,表觀遺傳修飾的效果比激活劑/阻遏物效果更好。Hilton等人發(fā)現(xiàn),,dCas9-p300的轉(zhuǎn)錄激活效果優(yōu)于dCas9-VP64,,特別是在靶定遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子時。這些工具的效果可能依賴于細(xì)胞類型和背景,因此在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時嘗試多種CRISPR工具,,也是不錯的想法,。 |
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