2016年年底,，來自加州大學(xué)伯克利分校的幾位科學(xué)家在Nature Reviews Drug Discovery（影響因子47.12）雜志上發(fā)表了一篇題為“Cornerstones of CRISPR–Cas in drug discovery and therapy”的綜述文章,。CRISPR“女神”Jennifer A. Doudna教授是這篇文章的共同作者。

基因組編輯工具CRISPR–Cas系統(tǒng)的飛速發(fā)展引發(fā)了生物學(xué)領(lǐng)域的一場革命,?；贑RISPR–Cas的技術(shù)實現(xiàn)了幾乎無限制的基因操作，包括在人類細(xì)胞中,。在這一綜述中,，作者們討論了CRISPR–Cas如何通過加速高價值靶點識別和驗證、發(fā)現(xiàn)高可信度的生物標(biāo)志物以及開發(fā)不同的突破性療法影響下一代藥物的開發(fā),。文章關(guān)注了這一革命性基因編輯技術(shù)將帶來的希望,，以及存在的缺陷和障礙，討論了不同CRISPR–Cas篩選平臺的關(guān)鍵特性,，提出了基因組編輯應(yīng)用的最佳實踐方案,。

文章在摘要中指出，通過在哺乳動物模型系統(tǒng)和人體組織中實現(xiàn)快速,、準(zhǔn)確地改變基因組信息,，基于CRISPR–Cas系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)已準(zhǔn)備好要改變藥物研發(fā)的多個階段。此外,，在患者中直接的體細(xì)胞編輯將最終從根本上改變成藥空間（druggable space）,。大量的研究證實了CRISPR–Cas系統(tǒng)多種巧妙的應(yīng)用（圖1）。

這一綜述主要包括以下四個部分：1）CRISPR–Cas作為一種藥物發(fā)現(xiàn)工具（CRISPR–Cas as a tool for drug discovery）,；2）CRISPR系統(tǒng)的特異性（Specificity of CRISPR systems）,；3）利用CRISPR–Cas開發(fā)治療方法（Using CRISPR–Cas to make therapeutics）；4）定義通往臨床之路（Defining a path to the clinic）,。

第一部分：作為一種藥物發(fā)現(xiàn)工具

精準(zhǔn)細(xì)胞模型

DNA測序的發(fā)展及其大規(guī)模的應(yīng)用讓人們認(rèn)識到了患者群體和普通人群之間的遺傳變異,，同時擴大了我們對遺傳變異與疾病傾向、疾病發(fā)展以及治療響應(yīng)之間關(guān)聯(lián)的理解,。這些進展刺激了個性化醫(yī)學(xué)或精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展,。然而，實現(xiàn)這兩種醫(yī)學(xué)模式往往需要精準(zhǔn)的遺傳模型,，用以評估擁有未知重要性的突變,，優(yōu)化患者的分類，開發(fā)已批準(zhǔn)藥物的新適應(yīng)癥以及替代性的治療模式。經(jīng)典的同源重組技術(shù)可用于生成相關(guān)的細(xì)胞模型,，但需要消耗大量的勞動力和時間,，阻礙了其在藥物開發(fā)中的廣泛使用。CRISPR–Cas基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)大大改了這一現(xiàn)狀（圖2）,。短短4年的時間,，它已被全球的科研人員接受并使用。

功能篩選

隨著研究人員揭開不同篩選系統(tǒng)的優(yōu)缺點,，CRISPR–Cas大規(guī)模的功能篩選功能同時也在發(fā)展和進化,。由于設(shè)計有效sgRNAs的簡便性，以及能夠用于幾乎任何細(xì)胞類型或組織,，CRISPR–Cas篩選系統(tǒng)很快在各種情況下被采用,。表1中，作者們比較了幾種篩選平臺的作用,、機制,、靶點選擇性等特點。

快速產(chǎn)生動物模型

除了在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用,，基因組編輯也顯著改變了我們產(chǎn)生疾病動物模型的能力（圖3）,。事實上，在CRISPR–Cas工具發(fā)展不久后,，它們就已被用于動物模型構(gòu)建中,。它的出現(xiàn)之所以會帶來新的希望，是因為傳統(tǒng)的基因靶向（gene targeting）在除小鼠之外的臨床前模型中依然是困難的,。這幾年,，CRISPR–Cas技術(shù)已被用于編輯大鼠、狗,、獼猴。這些動物模型也常用于臨床前的藥物開發(fā),。

第二部分：CRISPR系統(tǒng)的特異性

盡管基于CRISPR的工具很容易靶向基本上任何的基因組位點,，但它們也會產(chǎn)生脫靶編輯。脫靶位點是由核酸酶和sgRNA序列決定的,。因此,，科學(xué)家們開發(fā)出了大量預(yù)測sgRNA有效性和脫靶位點的算法。在這部分內(nèi)容中,，作者們談到了如何系統(tǒng)性地最小化CRISPR–Cas的脫靶效應(yīng),。他們提到的3個方向是：1）需要兩個Cas9切口酶，部分相關(guān)成果于2013年以“Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity”為題發(fā)表在Cell雜志上,；2）依賴sgRNA或蛋白質(zhì)工程實現(xiàn)更高的特異性,；3）嚴(yán)格控制細(xì)胞中活躍的Cas9酶的數(shù)量。

第三部分：利用CRISPR–Cas開發(fā)治療方法

除了用于產(chǎn)生強大的研究工具或模型，CRISPR–Cas技術(shù)本身也具有發(fā)展成藥物或療法的巨大潛能,。在該部分內(nèi)容中,，作者們討論了治療用基因編輯的現(xiàn)狀，以及CRISPR–Cas將如何對這一領(lǐng)域做出貢獻,。

利用基因編輯開發(fā)CAR-T細(xì)胞療法

近幾年,，癌癥免疫療法領(lǐng)域快速發(fā)展，科學(xué)家們也迅速將基因編輯技術(shù)應(yīng)用到其中,。目前,，有大量的研究集中在將這一技術(shù)應(yīng)用到CAR-T療法的開發(fā)中。

目前,，大部分的CAR-T細(xì)胞是利用患者自身的T細(xì)胞來產(chǎn)生,。這是一個昂貴、耗時的過程,。這一過程還受限于當(dāng)前的生產(chǎn)制造能力,。如果科學(xué)家們能夠想辦法生成通用型的CAR-T細(xì)胞，這類療法將有望變得更便捷,、更便宜,。因為，這些現(xiàn)成的（off-the-shelf）細(xì)胞將增加能夠接受單一CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品治療的患者數(shù)量,。

移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）和宿主排斥依然是這種“off-the-shelf”途徑的主要障礙,。包括ZFNs 和 TALENs在內(nèi)的基因編輯技術(shù)已經(jīng)在一些研究中被用于克服這些障礙,。在這里，小編為大家插播一項1月9日發(fā)表在Nature Medicine雜志上題為“Donor CD19 CAR T cells exert potent graft-versus-lymphoma activity with diminished graft-versus-host activity”的研究,。由美國紀(jì)念斯隆凱特林癌癥中心的科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的研究小組發(fā)現(xiàn),，同種異體供體CD19特異性的CD28z-CAR-T細(xì)胞在促進抗淋巴瘤活性的同時，所導(dǎo)致的GVHD發(fā)生的風(fēng)險是最少的,?！?a href="http://www./news/research/652745.html" target="_blank">詳細(xì)】

除了用于產(chǎn)生“off-the-shelf”版本的CAR-T細(xì)胞，基因組編輯技術(shù)還可以通過敲除編碼T細(xì)胞抑制性受體或信號分子的基因（如CTLA4,、PD1）提高CAR-T細(xì)胞的功效,。在這部分內(nèi)容中，作者們提到了美國NIH下屬Recombinant DNA Advisory Committee批準(zhǔn)的將由CAR-T大牛Carl June教授領(lǐng)導(dǎo)的一項CRISPR臨床試驗,。在該試驗中,，研究人員將利用Cas9在黑色素瘤靶向的CAR-T細(xì)胞中敲除編碼PD-1的基因以及內(nèi)源性T細(xì)胞受體的基因。此前,，據(jù)Nature Biotechnology雜志報道,，研究團隊計劃在今年第一季度開始I期臨床試驗,。【詳細(xì)】

這里也為大家插播一項Carl June教授去年11月在Clinical Cancer Research雜志上發(fā)表一篇論文（Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition）,。研究證實,，體外和動物模型研究中，CRISPR基因編輯CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出了強有力的抗腫瘤活性,。TCR和I類HLA雙重缺陷的T細(xì)胞同種異體反應(yīng)性（alloreactivity）降低,，且沒有導(dǎo)致GVHD。此外,，同時三重基因組編輯（增加了對PD-1基因的編輯）增強了CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性,。

該綜述也提到了由我國四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤學(xué)家盧鈾教授研究小組率先開展的全球首個CRISPR–Cas臨床試驗。雖然這一試驗沒有引入CAR,，但利用Cas9敲除了來自肺癌患者T細(xì)胞的PD-1,。一些類似的用PD-1敲除T細(xì)胞（PD1-knockout T cells）治療前列腺癌、膀胱癌和腎細(xì)胞癌的試驗也在啟動中,。

與ZFNs 和TALENs等其它基因編輯技術(shù)相比,，CRISPR–Cas能夠極快地測試任何新提出的基因改造。目前,，CAR-T療法開發(fā)者與專門從事基因編輯的公司之間已建立了大量的合作,，其中包括Novartis與Intellia Therapeutics 和 Caribou Biosciences、Juno Therapeutics與Editas Medicine,。此外,，致力于異體CAR-T療法開發(fā)的Cellectis公司從明尼蘇達大學(xué)獲得了一項使用TALENs的許可。

作者們表示,，未來的CAR-T療法將受益于內(nèi)源性T細(xì)胞受體基因,、組織相容性基因以及信號通路組成的聯(lián)合改造。不過,，需要注意的一點是,，通過刪除這些抑制性信號提高CAR-T活性的同時，也要保證CAR-T細(xì)胞不會失控增殖,。

體外基因編輯治療

文章還指出,，造血系統(tǒng)是體外基因編輯的最佳目標(biāo)。因為所需細(xì)胞可以從外周血樣本中快速獲得,，且能夠在被改造和擴增后進行回輸。作者們在該部分中介紹了一些基于造血干細(xì)胞基因編輯治療HIV的研究進展,。

第四部分：關(guān)于臨床

談及基因編輯技術(shù)的臨床之路,，作者們稱，體外研究和動物模型預(yù)測基因編輯療法在人類中副作用風(fēng)險的能力一直備受矚目,。最終,，患者,、醫(yī)生和監(jiān)管機構(gòu)必須討論在每個情況下可接受的風(fēng)險等級，并開發(fā)適當(dāng)?shù)陌踩胧?/p>

結(jié)論

CRISPR–Cas工具已被用于許多先前基因操作相對棘手的細(xì)胞和有機體中,。尤其在哺乳動物模型系統(tǒng)和人類細(xì)胞中,，這些技術(shù)能夠加速功能基因組學(xué)揭示細(xì)胞機制，鑒定或驗證新的藥物靶點,。利用CRISPR–Cas編輯動物將產(chǎn)生人類疾病更好的模型,，更具預(yù)測性的安全性測試，并改善患者的分層以及治療方案,。此外,，基因編輯技術(shù)的發(fā)展也有望幫助產(chǎn)生創(chuàng)新的療法，包括癌癥T細(xì)胞療法,、重編程iPSCs療法,。作者們稱：“我們相信，基因編輯已經(jīng)準(zhǔn)備好對實際的藥物開發(fā)產(chǎn)生直接的影響,?！盋RISPR-Cas將成為下一代轉(zhuǎn)化療法（Transformational Therapies）和治療模式的關(guān)鍵。