⊙作者：蔣超,，黃璐琦,，袁媛,，陳敏

⊙編輯：小余

中醫(yī)臨床各科治病、預(yù)防疾病均需用藥,，辨證施治,，理法方藥，最后都落實(shí)在中藥上,。因此,，歷代醫(yī)藥學(xué)家非常重視中藥材的質(zhì)量，特別是藥材的真假,?！耙晃镉兄嚕阈悦爸?，藥材真?zhèn)尾粌H與關(guān)乎治療效果,，而且還會(huì)關(guān)乎病人生命。性狀,、顯微,、理化、化學(xué)和生物鑒定構(gòu)成了現(xiàn)代中藥材鑒別方法的五大領(lǐng)域,，其中以DNA分子標(biāo)記為代表的生物鑒定方法已廣泛應(yīng)用于中藥材分子真?zhèn)舞b別,。

目前使用的DNA分子標(biāo)記主要包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性酶切長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP),、簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)多態(tài)性（ISSR）,、ITS序列分析、DNA條形碼技術(shù)等,。與傳統(tǒng)鑒別方法相比,，DNA分子標(biāo)記不受環(huán)境的影響，也不受基因表達(dá)與否的限制,，其數(shù)量豐富,、遺傳穩(wěn)定，對(duì)生物體的影響表現(xiàn)“中性”,，即可以對(duì)各發(fā)育時(shí)期的個(gè)體,、各個(gè)組織、器官甚至細(xì)胞作檢測(cè),；具有快速,、微量、特異性強(qiáng)以及操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn),。

與傳統(tǒng)鑒別相比,，分子鑒別也存在一些問(wèn)題。如RAPD與ISSR的穩(wěn)定性較差；PCR-RFLP需要進(jìn)行酶切及電泳分析,，實(shí)驗(yàn)步驟多,、周期長(zhǎng)；而DNA條形碼技術(shù)等則需要測(cè)序儀等大型儀器,，且對(duì)微量體積操作要求較高,。另一方面，分子鑒定技術(shù)鑒別單個(gè)樣品所需時(shí)間一般在2h以上,，與TLC薄層色譜或顯微鑒定20-30min即能獲得檢測(cè)結(jié)果相比,，其鑒別周期明顯延長(zhǎng),，難以滿足快速鑒別的要求,，限制了分子鑒別的推廣使用。

因此,，挖掘和開發(fā)新的分子標(biāo)記,，嘗試建立新方法，以滿足中藥材分子真?zhèn)舞b別準(zhǔn)確,、快速,、高通量、低成本的要求,，是一件任重而道遠(yuǎn)的工作,。本文以藥材金銀花真?zhèn)舞b別為例，比較了表達(dá)序列標(biāo)簽-簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性（Expresssequence tag - simple sequence repeat,，EST-SSR）,、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性酶切長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerasechain reaction–restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）,、位點(diǎn)特異性PCR（allele-specific PCR,，AS-PCR）和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)的原理,、特點(diǎn),、檢測(cè)方法以及檢測(cè)時(shí)間和應(yīng)用范圍等，并針對(duì)各方法的缺陷提出相應(yīng)的改進(jìn)之處,，以期篩選到適合金銀花快速真?zhèn)舞b別的方法,，也為其他中藥材分子鑒別研究提供示范。

一,、ESR-SSR

SSR又稱微衛(wèi)星,，一般指1到6個(gè)核苷酸的短串聯(lián)重復(fù)序列或2到8個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)。與其他分子標(biāo)記相比,，SSR具有分布廣泛,，共顯性遺傳，多態(tài)位點(diǎn)多，信息含量豐富,，物種間轉(zhuǎn)移性好,，易于檢測(cè)，重復(fù)性好的特點(diǎn),，在多種藥材和作物中已用于遺傳學(xué)的研究,。

由于金銀花基原植物忍冬與其主要偽品均屬忍冬屬植物，SSR分子標(biāo)記在屬的水平上具有良好的種間轉(zhuǎn)移性,，即同屬植物利用忍冬SSR分子標(biāo)記具有良好的通用性,，因此通過(guò)比較忍冬及其混偽品間SSR重復(fù)次數(shù)差異有可能獲得鑒別金銀花及其混偽品的分子標(biāo)記。本課題組通過(guò)EST來(lái)源的SSR引物jp.ssr4,、jp.ssr64,、jp.ssr65可準(zhǔn)確鑒別金銀花的原植物忍冬、變種紅白忍冬,，混偽品山銀花的來(lái)源植物紅腺忍冬,、灰氈毛忍冬、華南忍冬,、黃褐毛忍冬,，對(duì)于鑒定中藥來(lái)源、保護(hù)中藥原植物品種具有應(yīng)用價(jià)值,。

二,、PCR-RFLP

PCR-RFLP又稱CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites)，是一種利用PCR擴(kuò)增目的片段DNA,，再使用特定的核酸內(nèi)切酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物,，直接通過(guò)凝膠電泳分辨DNA條帶大小及多態(tài)性，從而檢測(cè)酶切位點(diǎn)處是否發(fā)生突變的一種技術(shù),。由于該方法操作簡(jiǎn)單,、特異性好、分型時(shí)間相對(duì)較短,，在中藥鑒定中具有重要作用,，研究者先后使用PCR-RFLP對(duì)大黃、木通,、澤瀉,、川貝母、人參等中藥進(jìn)行了分子鑒定,。

由于大多數(shù)鑒別的分子標(biāo)記均來(lái)自于ITS,、18S等核基因序列或psbA-trnH、trnL-trnF,、matK,、rbcL等葉綠體片段,，利用這些片段并通過(guò)序列比對(duì)，尋找藥材真?zhèn)纹烽g穩(wěn)定的變異位點(diǎn),，分析變異位點(diǎn)是否位于內(nèi)切酶識(shí)別序列上并導(dǎo)致了識(shí)別位點(diǎn)的改變,，從而產(chǎn)生酶切圖譜多態(tài)性。

忍冬屬植物在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公開了16個(gè)備選DNA條形碼的1002條序列,，提供了豐富的DNA分子標(biāo)記資源,。通過(guò)序列比對(duì)，本課題組成功獲得了2個(gè)金銀花及其混偽品的鑒別位點(diǎn),，它們分別位于HinfI核酸內(nèi)切酶及NlaIV核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)上,。由于金銀花混偽品因序列變異導(dǎo)致識(shí)別位點(diǎn)丟失，因而無(wú)法被這兩種內(nèi)切酶切開,。本課題組基于以上2個(gè)金銀花與同屬混偽品的特異性酶切位點(diǎn)多態(tài)性標(biāo)記,，建立了金銀花類中藥的PCR-RFLP鑒別方法。

三,、位點(diǎn)特異性PCR

AS-PCR又稱擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng),，是1989年由Newton等人在PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種SNP分型方法，包括不引入錯(cuò)配的擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)和在引物3’端引入人為錯(cuò)配的位點(diǎn)特異性PCR,。該方法原理為當(dāng)野生型和突變型具有單堿基的變異時(shí)，將突變堿基設(shè)計(jì)于突變引物的3′端,，引物與野生型完全匹配,，與突變型在3′末端有一個(gè)堿基的不匹配。由于Taq酶缺乏3′→5′外切酶活性,，突變型延伸反應(yīng)因磷酸酯鍵形成困難而受阻,，擴(kuò)增速度大為減弱。而野生型引物與模板DNA完全匹配,，擴(kuò)增時(shí)不受影響,。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，只有野生型得到有效擴(kuò)增,，從而在凝膠電泳圖譜上呈現(xiàn)差異,。位點(diǎn)特異性PCR只需要PCR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)或擴(kuò)增產(chǎn)物的量即可進(jìn)行SNP分型,，具有快速,、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，已成功用于人參,、陳皮,、荊芥、藁本等中藥材的真?zhèn)舞b別,。

雙向位點(diǎn)特異性PCR(Bidirectional PCR amplification of specific alleles,，Bi-PASA)，是在位點(diǎn)特異性PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展出來(lái)的一種SNP分型方法，在單位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物,，使得變異位點(diǎn)位于兩引物的3’末端,，分別擴(kuò)增SNP位點(diǎn)兩側(cè)的核苷酸序列，兩引物分別與野生型或突變型完全匹配,，然后在兩引物外側(cè)設(shè)計(jì)與序列完全匹配的兼容引物,，使得兩對(duì)引物擴(kuò)增長(zhǎng)度不同，故而通過(guò)單次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度差異即同時(shí)檢測(cè)兩種基因型,。本課題組基于金銀花及其混偽品葉綠體序列,，篩選獲得4個(gè)金銀花鑒別的SNP位點(diǎn)，并建立了雙向位點(diǎn)特異性PCR用于金銀花真?zhèn)渭盎祀s品鑒別方法,。

四,、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是Notami等人在2000年提出的一種等溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)。其通過(guò)4引物識(shí)別目的基因的6個(gè)區(qū)域,，使用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶,，在恒溫條件（60-65℃）下進(jìn)行核酸的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，通過(guò)在擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)引發(fā)下一輪引物結(jié)合,，LAMP能在40-60min內(nèi)把目的片段擴(kuò)增到109數(shù)量級(jí),，并且具有良好的序列特異性，在中藥鑒定中具有良好的應(yīng)用前景,。由于LAMP技術(shù)是一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),，只需要恒溫加熱槽即可滿足實(shí)驗(yàn)要求，并且由于其擴(kuò)增產(chǎn)物量大,，加入染料后在紫外或可見光波段用肉眼判定顏色變化就可鑒別擴(kuò)增反應(yīng)的有無(wú),，非常有利于中藥快速鑒別或現(xiàn)場(chǎng)鑒別，研究者利用該技術(shù)鑒別了人參,、姜黃,、長(zhǎng)春花、蟲草,，白花蛇舌草等,。

LAMP鑒別標(biāo)記的來(lái)源廣泛，包括：

（1）通用引物序列標(biāo)記,。Sasaki等通過(guò)使用18S或ITS序列的鑒別位點(diǎn),，設(shè)計(jì)LAMP引物，用于鑒別人參,、姜黃等,。

（2）多態(tài)性標(biāo)記。Chaudhary等使用RAPD擴(kuò)增長(zhǎng)春花及其偽品,，獲得一個(gè)610bp的長(zhǎng)春花特有片段,，利用該標(biāo)記設(shè)計(jì)LAMP引物,，成功鑒別了長(zhǎng)春花及其偽品。

（3）功能基因標(biāo)記,。李奎等比對(duì)冬蟲夏草及其常見偽品的Serine蛋白的核酸序列,，開發(fā)成LAMP標(biāo)記，用于鑒別冬蟲夏草,、亞香棒蟲草,、古尼蟲草等常見蟲草偽品。本課題組通過(guò)對(duì)序列進(jìn)行分析,，篩選獲得trnL-trnF序列上的1個(gè)SNP位點(diǎn)用于設(shè)計(jì)LAMP引物,，并初步建立了金銀花及其混偽品的LAMP鑒別方法。

五,、幾種金銀花分子鑒別方法的比較

本課題組已開發(fā)的4種金銀花分子鑒別新方法主要基于PCR和LAMP擴(kuò)增,，其標(biāo)記來(lái)源、檢測(cè)方法,、特點(diǎn)各有不同,，導(dǎo)致在中藥材分子鑒別中的應(yīng)用情況也存在差異（表1）。

表1 四種金銀花分子鑒別方法的比較分析

表1  四種金銀花分子鑒別方法的比較分析（續(xù)表）

1. EST-SSR

（1）優(yōu)點(diǎn)：EST-SSR多態(tài)位點(diǎn)多,，信息含量高,，可反映豐富的遺傳變異信息，可用于近緣物種的鑒別,。且SSR多通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)進(jìn)行分型,，成本較低。

（2）缺點(diǎn)：SSR標(biāo)記大多通過(guò)文庫(kù)構(gòu)建或高通量測(cè)序獲得,，前期投入大。雖然可以使用磁珠吸附法獲得SSR標(biāo)記,，但標(biāo)記開發(fā)投入依然很大且后期也需要大量引物的篩選,，不利于鑒別引物的開發(fā)。分型時(shí)聚丙烯酰胺凝膠電泳一般需要長(zhǎng)達(dá)3 h,，且凝膠配制過(guò)程,、銀染過(guò)程均需要花費(fèi)1h以上，不利于快速,、高通量鑒定,。雖然使用測(cè)序儀進(jìn)行STR分型可以減少檢測(cè)時(shí)間，但STR分型需要使用熒光標(biāo)記引物,，增加了鑒別成本,。

2.PCR-RFLP

（1）優(yōu)點(diǎn)：與EST-SSR相比，PCR-RFLP分子標(biāo)記可通過(guò)比對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列分析獲得,，成本低,，且PCR-RFLP對(duì)DNA模板質(zhì)量要求很低,、穩(wěn)定性好。對(duì)于藥材來(lái)說(shuō),，其DNA降解嚴(yán)重的情況非常適用,。與RFLP相比，PCR-RFLP對(duì)用于進(jìn)行鑒別材料的DNA量和DNA質(zhì)量要求更低,，僅需少量材料就可完成分型,。

（2）缺點(diǎn)：PCR-RFLP非常依賴于內(nèi)切酶的種類，要求鑒別位點(diǎn)正好位于內(nèi)切酶的識(shí)別序列上,，并導(dǎo)致識(shí)別位點(diǎn)的改變,。然而由于限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列多為嚴(yán)格的回文序列，在序列中出現(xiàn)的概率不是很高,，對(duì)于識(shí)別6堿基的內(nèi)切酶來(lái)說(shuō),，平均每4096個(gè)核苷酸才能遇到一個(gè)酶切位點(diǎn)。盡管有些內(nèi)切酶識(shí)別序列具有簡(jiǎn)并性,，如NlaIV識(shí)別序列為GGNN^CC（N=A/T/C/G）,，但內(nèi)切酶的種類相對(duì)極少。限制性內(nèi)切酶的主要生產(chǎn)公司銷售的內(nèi)切酶種類有限也是制約PCR-RFLP標(biāo)記開發(fā)的主要因素,。巢式PCR-RFLP雖然允許變異位點(diǎn)不在酶切位點(diǎn)上,，但導(dǎo)致酶切后序列長(zhǎng)度差異很小，需要使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行片段分離,，增加了操作步驟,、延長(zhǎng)了分型時(shí)間。

PCR-RFLP由于需要長(zhǎng)時(shí)間酶切,，導(dǎo)致分型時(shí)間一般在5h以上,，不利于快速鑒別。新出現(xiàn)的快速作用內(nèi)切酶,，如FastDigest內(nèi)切酶或QuickCutTM內(nèi)切酶可以在5-15min內(nèi)完成酶切反應(yīng),，將有效縮短PCR-RFLP分型時(shí)間。

3.AS-PCR

（1）優(yōu)點(diǎn)：由于單核苷酸多態(tài)性(SNP)在基因組水平上廣泛存在,，因其分布廣泛,、數(shù)量眾多，雙等位特性易于檢測(cè),，常用來(lái)研究物種的起源與進(jìn)化,，進(jìn)行物種的鑒定，在藥材近緣種鑒別研究中具有重要意義,。位點(diǎn)特異性PCR是一種基于SNP位點(diǎn)的基因分型方法,，由于該方法只需要進(jìn)行PCR，然后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳,，根據(jù)電泳條帶的大小及有無(wú)即可區(qū)分野生和突變的基因型,，具有操作簡(jiǎn)單,、快速的特點(diǎn)，非常有利于中藥的快速鑒別,。而在位點(diǎn)特異性PCR基礎(chǔ)上發(fā)展出的雙向等位基因特異性PCR僅通過(guò)單個(gè)SNP位點(diǎn)即可區(qū)分兩種基因型,，具有共顯性、易于檢測(cè)的特點(diǎn),，在藥材真?zhèn)纹房焖贆z測(cè)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),。位點(diǎn)特異性性PCR是一種基于PCR鑒別的方法，該方法只需要PCR擴(kuò)增,、凝膠電泳即可區(qū)分任意的SNP位點(diǎn),，非常適用于金銀花與其偽品等近緣物種快速鑒別。并且,，與PCR-RFLP相同,，鑒別位點(diǎn)可以從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中開發(fā)，成本較少,。在操作方面,，該方法操作簡(jiǎn)單、鑒別快速,，并且不需要大型儀器如測(cè)序儀等,，與SSR及PCR-RFLP相比檢測(cè)的靈活性有所增加。

（2）缺點(diǎn)：位點(diǎn)特異性PCR對(duì)SNP位點(diǎn)周圍序列具有一定要求,，并不是每一個(gè)位點(diǎn)均能通過(guò)位點(diǎn)特異性PCR進(jìn)行SNP分型,，其方法的建立主要取決于以下三個(gè)方面：

①由于位點(diǎn)特異性PCR引物序列嚴(yán)格依賴于SNP位點(diǎn)上下游序列，當(dāng)位點(diǎn)周圍序列AT含量過(guò)高,、存在重復(fù)序列或可以形成嚴(yán)重發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí),，導(dǎo)致引物設(shè)計(jì)困難。

②在實(shí)驗(yàn)操作方面,，引物篩選和實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化過(guò)程較復(fù)雜,。位點(diǎn)特異性PCR對(duì)反應(yīng)條件要求嚴(yán)格，其退火溫度,、酶量、引物量,、循環(huán)數(shù),、模板濃度、Taq酶種類都可能影響SNP分型結(jié)果,，導(dǎo)致該方法應(yīng)用推廣過(guò)程中,，如更換Taq酶或PCR儀時(shí)，需要重新調(diào)校退火溫度,。

③位點(diǎn)特異性PCR主要包括DNA提取,、PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè)3個(gè)步驟,，每個(gè)步驟均依賴大型儀器如離心機(jī)、PCR儀,、凝膠成像系統(tǒng)等,，對(duì)儀器的依賴性導(dǎo)致該方法便攜性不夠，無(wú)法用于田野或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),。

4.LAMP

（1）優(yōu)點(diǎn)：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),，與基于PCR的鑒別方法相比，LAMP法擴(kuò)增量大,，檢測(cè)時(shí)間短,，僅1-2 小時(shí)內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果；且儀器要求寬松,，不需要普通PCR所需的PCR儀,、電泳槽及凝膠成像系統(tǒng)，只要一個(gè)水浴鍋就可完成檢測(cè)反應(yīng),，可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),；操作也較簡(jiǎn)單，整個(gè)過(guò)程不涉及復(fù)雜的儀器設(shè)備,；檢測(cè)結(jié)果清晰,，只用肉眼觀察顏色即可判斷。與PCR鑒別一樣,，LAMP檢測(cè)法鑒別標(biāo)記來(lái)源廣泛,，真?zhèn)纹凡町愇稽c(diǎn)均可開發(fā)成LAMP引物，非常適合中藥的分子鑒別,。

（2）缺點(diǎn)：主要包括以下3個(gè)方面：

① 適合具有大片段或多位點(diǎn)差異物種的鑒別,。對(duì)于近緣物種鑒別，由于其序列變異小,，甚至只有單個(gè)核苷酸位點(diǎn)變異,，難以進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)。

②對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格,，需要良好的控溫措施,。尤其是對(duì)近緣物種的鑒別，需要非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件,。如金銀花與其同屬偽品LAMP鑒別,，溫度需嚴(yán)格控制在65℃。

③ LAMP引物對(duì)GC含量,、Tm值,、引物位置及序列GC含量均有很高要求，其開發(fā)相對(duì)PCR引物較難,。由于LAMP使用4條引物識(shí)別6個(gè)區(qū)域,，兩個(gè)內(nèi)引物長(zhǎng)度一般均在40-50 bp左右,，容易形成強(qiáng)烈的引物二聚體，影響擴(kuò)增效率,，或產(chǎn)生假陰性,、假陽(yáng)性結(jié)果，引物篩選和實(shí)驗(yàn)條件的確定需要長(zhǎng)時(shí)間的摸索才能建立,。

六,、展望

相對(duì)于傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別、顯微鑒別及理化鑒別來(lái)說(shuō),，DNA分子鑒別技術(shù)準(zhǔn)確度高,，并且不受取樣部位、發(fā)育時(shí)間,、環(huán)境差異影響,，可以對(duì)破碎中藥甚至中成藥進(jìn)行鑒別，將會(huì)在中藥真?zhèn)舞b別中起到越來(lái)越重要的作用,。目前中藥分子鑒定的主流是基于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法,，與傳統(tǒng)方法相比，PCR技術(shù)可以使用96孔板等進(jìn)行大數(shù)目樣品的并行檢測(cè),，對(duì)于大量樣品,、破碎或粉末樣品、微量或貴重樣品,、無(wú)特征成分樣品的鑒定具有重要意義,。PCR技術(shù)需要的主要儀器包括PCR儀、凝膠電泳儀,、凝膠成像系統(tǒng)或測(cè)序儀等,，因便攜性方面的缺點(diǎn)，DNA分子鑒別主要在實(shí)驗(yàn)室或藥檢部門進(jìn)行,。然而,，隨著中藥商品化市場(chǎng)的擴(kuò)大，醫(yī)院藥房,、藥市,、種植基地等對(duì)中藥分子鑒別提出了新的要求及挑戰(zhàn)——即中藥現(xiàn)場(chǎng)鑒別，由于抽檢樣品數(shù)目巨大,，而現(xiàn)場(chǎng)鑒別的工作人員沒(méi)有長(zhǎng)時(shí)間的專業(yè)培訓(xùn),，鑒別方法選擇必須考慮實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、步驟少,、儀器依賴性低等因素。

位點(diǎn)特異性PCR,、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),、DNA試紙條技術(shù)等通過(guò)條帶有無(wú)進(jìn)行鑒定的技術(shù)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合,，通過(guò)顏色或發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行鑒別將會(huì)在中藥現(xiàn)場(chǎng)鑒別中起到越來(lái)越重要的作用。另一方面,，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)如LAMP,、解旋酶依賴的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（HDA）,滾環(huán)擴(kuò)增，重組酶擴(kuò)增等只需要水浴鍋或恒溫加熱槽即可進(jìn)行鑒別,，儀器依賴性低,，操作簡(jiǎn)單，也逐漸顯示出了在中藥分子鑒定中的應(yīng)用潛力,。

參考文獻(xiàn)：略,。