CRISPR

常青樹 2016-10-11

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4月15日，隸屬于麻省理工學院和哈佛大學的世界著名生物醫(yī)學研究機構Broad研究所宣布,，美國專利局批準了由他們所申請的基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術專利,。這是目前世界第一例獲得專利保護的基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術。

正在生物體內發(fā)揮功能的CRISPR-Cas9系統(tǒng),。插畫家：Stephen Dixon

所謂基因編輯技術,，是指對DNA核苷酸序列進行刪除和插入等操作，換句話說,，基因編輯技術使得人們可以依靠自己的意愿改寫DNA這本由脫氧核苷酸寫而成的生命之書,。然而長期以來，對DNA的編輯只能通過物理和化學誘變,、同源重組等方式來對DNA進行編輯,。然而這些方法要么編輯位置隨機，要么需要花費大量人力物力進行操作,。因此,，能夠方便而精確的對DNA和核苷酸序列進行編輯，是科研工作者們長期以來的夢想,。CRISPR-Cas9系統(tǒng)的誕生和成熟標志這這一夢想逐漸變?yōu)楝F(xiàn)實,。此外不僅僅在科研界，在諸如醫(yī)療,、農業(yè),、畜牧業(yè)等研究中，這一技術也顯現(xiàn)除了巨大的應用前景,。因此,，這一技術獲得專利，是該技術走向應用的里程碑式事件,。

從細菌免疫系統(tǒng)到DNA編輯工具

CRISPR-Cas9系統(tǒng)并非天生就是為人類使用而產生的,。它的本質其實是細菌中一種對付諸如病毒等外來DNA的防御系統(tǒng),。在一些細菌基因組中存在一系列成簇排列的DNA序列，被稱作“規(guī)律間隔成簇短回文重復序列”（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,，CRISPR）,。這些重復序列的間隔序列，被發(fā)現(xiàn)和很多能夠侵入細菌的噬菌體DNA序列相同,。進一步研究發(fā)現(xiàn),，這些序列在被轉錄成為RNA后，能夠和細菌產生的一類稱為Cas的蛋白質形成復合體,，來對Cas蛋白起到導向作用,，因此這段RNA也被稱為導向RNA（guide RNA，gRNA）,。當復合體檢測到入侵的DNA和gRNA序列一致時,，Cas蛋白就能夠切割入侵的DNA，達到防御的目的,。

注：嚴格來說,，在細菌體內gRNA由兩部分組成：一部分為活化Cas蛋白所需的tracrRNA，另一部分為來自于間隔區(qū),、識別入侵DNA的crRNA。在人工構建的CRISPR-Cas9系統(tǒng)載體中,，這兩段RNA可融合為一條,。

CRISPR-Cas系統(tǒng)這種序列特異性的DNA切割機制很快引起了人們的興趣。由于這一系統(tǒng)能夠切割DNA,，并且其序列特異性由crRNA的序列所決定,，因此它成為了DNA編輯的理想工具。細菌中的CRISPR-Cas系統(tǒng)極為多樣,，而一個來自產膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的由Cas9蛋白參與的系統(tǒng)被人們研究的最為透徹,。因此人們對它進行了改造，將編碼Cas9蛋白的序列及其附屬元件共同制造成為一個單一的載體,。同時為了能夠讓這些組分進入真核細胞的細胞核,，還加入了入核信號元件。這樣一來,，只要科研人員只需針對需要編輯的DNA序列合成一段DNA序列,，插入這個載體的特定部位。在轉入宿主細胞后,，產生的人工構建的gRNA就能指導Cas9蛋白切割宿主細胞特定的DNA序列,，從而起到基因編輯的作用。

CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)示意,。圖片來源：《生物化學與生物物理進展》

DNA編輯的廣泛前景

CRISPR-Cas9系統(tǒng),，被稱為第三代基因編輯技術,。相比于它的兩位前輩ZFN系統(tǒng)和TALEN系統(tǒng)，它有著一些無可比擬的優(yōu)點,。首先,，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的可用位置更多。理論上基因組中每8個堿基就能找到一個可以用CRISPR-Cas9進行編輯的位置,，可以說這一技術能對任一基因進行操作,，而TALEN和ZFN系統(tǒng)則在數百甚至上千個堿基中才能找到一個可用位點，這大大限制了使用范圍,。其次,，CRISPR-Cas9系統(tǒng)更具有可拓展性，例如可以通過對Cas9蛋白的修飾,，讓它不切斷DNA雙鏈,，而只是切開單鏈，這樣可以大大降低切開雙鏈后帶來的非同源末端連接造成的染色體變異風險,。此外還可以將Cas9蛋白連接其他功能蛋白,，來在特定DNA序列上研究這些蛋白對細胞的影響。第三,，更為重要的是,，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的使用極為方便，只需要簡單的幾步就能完成,，幾乎任何實驗室都可以開展工作,，而不需要向ZFN和TALEN那樣借助商業(yè)公司的協(xié)助完成。由于以上特點,，CRISPR-Cas9被評為2013年生物學10大突破之一,。值得說明的是，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在真核細胞中很多重要的研究,，都是由華人學者張峰主持完成的,。

由于來源于細菌的CRISPR-Cas9系統(tǒng)在真核細胞內也能很好的工作，這顯示出了其巨大的應用潛力,。例如在基礎科學研究領域,，CRISPR-Cas9系統(tǒng)最多的是被用來定點敲除一些基因，從而便于研究這些基因的生物學功能,。同時CRISPR-Cas9系統(tǒng)的商業(yè)化應用潛力也不容小視,。例如在生物治療領域，結合誘導多能干細胞（iPS）技術,，人們可以將通過基因編輯修復的iPS細胞重新發(fā)育為正常組織和器官來供病人使用,。而在家畜育種等工作中，對一些關鍵性狀基因的編輯能夠大大加快良種的育種速度,。

正是由于CRISPR-Cas9的諸多優(yōu)秀特點和廣泛的應用前景,，因此它成為了專利申請的熱門方面,。盡管已經有多份應用CRISPR序列或Cas蛋白的技術專利，但這次Broad研究所獲得批準的是第一份將一整套CRISPR-Cas9系統(tǒng)載體和操作方法包括在內的專利,。這意味著今后使用這一技術進行基因編輯操作都將涉及這份專利所保護的內容,。那么，專利的批準是否會妨礙這一技術的使用呢,？目前來看,，基礎研究受到影響的可能性不大，因為Broad研究院的主任埃里克·蘭德（Eric Lander）在專利宣布的新聞稿中表示：“考慮到Broad研究所的使命是為了加速我們對于疾病的理解和治療,，因此我們承諾授權給全球的研究團隊使用這種技術的權利,。”但是,，在更有利可圖的商業(yè)化應用領域,，這一專利的出現(xiàn)是否會對使用該技術的企業(yè)造成影響還有待觀察，畢竟Broad研究所在上述表態(tài)之外還有一句：“享有這一專利的限制權”,。