楊揚(yáng)  中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院

　　干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞,，其中多能干細(xì)胞可分化為全身各種細(xì)胞、組織,，包括胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells,，ESCs）及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）兩大類(lèi),。在體外誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化形成功能完善的細(xì)胞,、組織、器官是其進(jìn)一步臨床應(yīng)用的基礎(chǔ),。目前已有大量定向分化為特定功能細(xì)胞類(lèi)型的報(bào)道,，包括神經(jīng)、血管內(nèi)皮組織,、肝細(xì)胞樣細(xì)胞,、心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞等,，進(jìn)而逐步向體外生成類(lèi)器官乃至實(shí)質(zhì)器官邁進(jìn),。目前利用多能干細(xì)胞生產(chǎn)人類(lèi)組織器官的主要方法有：生物材料支架構(gòu)建組織工程器官、脫細(xì)胞組織/器官支架構(gòu)建組織工程器官,、干細(xì)胞分化成為類(lèi)器官樣組織,、通過(guò)嵌合體生產(chǎn)人類(lèi)組織器官。

　　該方法利用高分子材料預(yù)先構(gòu)制鑄型,，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供附著點(diǎn)和微環(huán)境支持,，以期維持特定的三維形態(tài)結(jié)構(gòu)或發(fā)揮特定生理功能，從而形成臨床可應(yīng)用的人工器官,。早期研究顯示使用高分子可降解材料經(jīng)耳形壓模,，制成耳廓支架，然后將牛軟骨細(xì)胞接種于支架,，經(jīng)體外培養(yǎng)1~2周后植入裸鼠背部皮下可形成具有3D結(jié)構(gòu)的新生耳廓組織,。而將肝細(xì)胞在生物材料上形成的組織片移植到小鼠體內(nèi)可發(fā)揮類(lèi)似的生理功能。iPSCs的發(fā)現(xiàn)極大地豐富了該技術(shù)的細(xì)胞來(lái)源,。生物支架具有生物相容性,、可降解、基質(zhì)孔徑可控并促進(jìn)血管生成的優(yōu)點(diǎn),，結(jié)合自身來(lái)源的iPSCs定向分化的細(xì)胞種植,，所構(gòu)建的人工器官可有效避免移植排異反應(yīng)的發(fā)生，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),。　　

　　器官的脫細(xì)胞化是指在維持原器官總體形態(tài)的基礎(chǔ)上,，通過(guò)灌注洗脫器官內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞而保留含有脈管結(jié)構(gòu)的細(xì)胞基質(zhì)骨架的過(guò)程。人工氣管移植治療終末期氣管軟化癥作為該技術(shù)的先驅(qū)首先應(yīng)用于臨床,。將供體氣管上細(xì)胞及MHC抗原分子洗脫,，接種上受體來(lái)源的上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)的軟骨細(xì)胞，而后移植給受者,，成功避免了免疫排斥反應(yīng)并獲得了可喜的療效,。

　　在肝臟再生研究領(lǐng)域，研究發(fā)現(xiàn)利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細(xì)胞的過(guò)程中,，肝細(xì)胞的功能及表型會(huì)快速丟失,。體外培養(yǎng)完整肝臟器官必須解決細(xì)胞存活及代謝所必需的能量供給和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)問(wèn)題，首先要構(gòu)建細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的血管網(wǎng)及其依附的基質(zhì)骨架,。由于肝臟基質(zhì)組分繁雜,，結(jié)構(gòu)精細(xì)，在體外人工直接構(gòu)建肝臟基質(zhì)骨架難以實(shí)現(xiàn),，而通過(guò)洗脫供肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞獲得骨架更具可行性,。Uygun等首次報(bào)道了利用脫細(xì)胞化的肝臟成功制備了可供移植的再細(xì)胞化人工器官。移植的肝細(xì)胞利用基質(zhì)骨架保留了血管網(wǎng)結(jié)構(gòu),，經(jīng)體外灌注培養(yǎng)后植入體內(nèi),，能夠維持在原位并發(fā)揮功能。因此,，脫細(xì)胞骨架可以誘導(dǎo)細(xì)胞遷徙,、定位、分化，并為細(xì)胞的增殖提供必要的基礎(chǔ)構(gòu)架及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),。

　　目前研究多基于原代肝細(xì)胞及胎兒肝細(xì)胞的再細(xì)胞化,，臨床大規(guī)模應(yīng)用受到可獲取的細(xì)胞數(shù)量及倫理限制。干細(xì)胞誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞已獲得成功,，為構(gòu)建再細(xì)胞化人類(lèi)完整肝臟所需的大量肝臟細(xì)胞提供了潛在的來(lái)源,，特別是iPSCs誘導(dǎo)的具有個(gè)體特異性的肝細(xì)胞，可有效避免排斥反應(yīng),，是極具潛力的供移植應(yīng)用的細(xì)胞類(lèi)別,。　　

　　隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，研究發(fā)現(xiàn),，在3D Matrigel中培養(yǎng)的細(xì)胞可分化為類(lèi)器官,，肝臟類(lèi)器官亦被成功培養(yǎng)，其細(xì)胞懸液經(jīng)脾內(nèi)注射后可于受體肝臟內(nèi)增殖分化出含肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞的團(tuán)塊,。Takebe等誘導(dǎo)iPSCs直接分化為肝臟內(nèi)胚層細(xì)胞（iPSC-HEs）,，而后與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）及間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）共同培養(yǎng)，形成肝芽,，接著異位移植于免疫缺陷小鼠腹腔內(nèi),，最終形成血管化的類(lèi)肝器官并發(fā)揮肝臟的代謝功能。該發(fā)現(xiàn)開(kāi)創(chuàng)性地在體外成功演繹了器官發(fā)生過(guò)程,，為培養(yǎng)具有個(gè)體特異性的可供移植的肝臟帶來(lái)了新的希望,。由于類(lèi)器官的形態(tài)及功能與機(jī)體發(fā)育正常的器官間仍有較大差距，目前僅適用于器官發(fā)生學(xué)研究,、疾病模型的構(gòu)建以及生理,、病理和藥物毒理學(xué)相關(guān)研究。　　

　　1984年,，F(xiàn)ehilly等人構(gòu)建了遺傳距離更遠(yuǎn)（約4％）的山羊與綿羊的嵌合體,，在毛色、體態(tài),、組織器官等方面均表現(xiàn)出不同程度的嵌合,，同時(shí)嵌合體還可以長(zhǎng)期存活，未發(fā)現(xiàn)明顯異常,。2008年,，項(xiàng)鵬等報(bào)道了基于Apodemus sylvaticus/ Mus musculus兩個(gè)物種（遺傳上的差距是18％）建立的異種嵌合體動(dòng)物模型。這些研究提示有可能建立人和猴的嵌合體,，利用猴生產(chǎn)人類(lèi)器官,。近年發(fā)現(xiàn)的新型的基因編輯載體TALEN和CRISPR/Cas9為精準(zhǔn)、高效的非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物基因敲除提供了有利武器,。近期,，項(xiàng)鵬課題組利用該技術(shù)成功構(gòu)建了食蟹猴MCPH1突變模型及Shank3突變的自閉癥模型等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型,。同時(shí)研究證實(shí)食蟹猴ES細(xì)胞可在豬體內(nèi)發(fā)育形成猴豬嵌合體。由于正常動(dòng)物體內(nèi)嵌合率較低,，難以形成完整器官,，因此，可以考慮利用猴基因缺陷模型,，抑制受體特定器官的分化,、發(fā)育,，使得植入的細(xì)胞形成增殖優(yōu)勢(shì),，實(shí)現(xiàn)定向的器官再生。同時(shí)使用神經(jīng)特異/生殖細(xì)胞特異啟動(dòng)子攜帶自殺基因,，避免倫理問(wèn)題,。該構(gòu)想為人工器官的生產(chǎn)提供了新的思路。

　　綜上所述,，干細(xì)胞-組織工程技術(shù)在近年取得了長(zhǎng)足進(jìn)步,，為解決器官短缺問(wèn)題提供了新的思路。

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