關于通過監(jiān)測非結構蛋白抗體來

評價口蹄疫疫苗純度的研究進展

摘要：口蹄疫 （Foot and Mouth Disease，FMD） 是由口蹄疫病毒引起的在偶蹄動物間傳播的 A 類烈性傳染病,。大多數發(fā)展中國家一直都通過注射滅活疫苗的辦法來控制該病的流行,，如何評價和控制口蹄疫疫苗質量成為關鍵。OIE 建議,，通過監(jiān)測接種至少兩次口蹄疫疫苗的動物血清是否產生非結構蛋白抗體,，來評價口蹄疫疫苗純度，從而為獸用生物制品廠家提供一種可供參考的質控方法,?？傊褂酶咝У男滦鸵呙绮⒔Y合不同檢測方法,，給預防和消滅 FMD 帶來希望,。

口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒引起的在偶蹄動物間傳播的烈性傳染病,，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）和聯(lián)合國糧農組織（FAO）列為 A 類動物傳染病之首,。口蹄疫病原是口蹄疫病毒,，屬微核糖核酸病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒屬 （Aphthavirus）,，有 A,、O、C,、SAT1,、 SAT2、SAT3 以及 Asia 1 型 7 個血清型,，每個血清型又包含若干個亞型,。該病毒不僅在各型間沒有交叉免疫性，同血清型的各亞型之間也僅有部分交叉免疫性,。該病傳播快,、宿主范圍廣、發(fā)病率高,，對畜牧業(yè)發(fā)展構成極大威脅,。大多數亞洲、非洲,、南美洲國家一直都通過注射滅活疫苗的辦法來控制該病的流行,。因此，使用高質量安全有效的疫苗,，是成功預防控制直至最終消滅 FMD 的先決條件,。

1  口蹄疫滅活疫苗

FMD 疫苗的整個研究和應用情況看，活毒疫苗由于其自身固有的缺陷,，已經被世界上許多國家摒棄,；新型疫苗雖然取得一些非常有前途的結果，但在免疫效力和經濟上目前難與常規(guī)疫苗競爭,。常規(guī)滅活疫苗仍然是當前 FMD 免疫控制采 用的主要疫苗,。

FMD 滅活疫苗誘發(fā)有效的免疫應答，通常需要較大量的抗原,，即疫苗的抗原含量直接決定了疫苗的質量和免疫效果,。低抗原含量意味著疫苗效力低和免疫持續(xù)期短，高抗原含量意味著疫苗效力高和免疫持續(xù)期長,。

因此,，在滅活疫苗特別是多價苗生產中，為了獲得高效的疫苗保證免疫效果,，降低疫苗使用劑量,，同時降低疫苗中非病毒蛋白引起的變態(tài)反應，減少接種引起的有害反應,，利于病毒抗原和成品苗的貯存,，便于免疫和感染的鑒別，就必須對病毒抗原進行濃縮純化。

現在常用于大規(guī)模生產的純化濃縮方法是超濾和聚乙二醇 （PEG）或聚乙烯氧化物（PEO）沉淀法和色譜柱過濾法等,，不僅可以達到理想的濃縮倍數,，還可大大降低抗原收獲物中非病毒蛋白成分及含量。用超濾法濃縮 FMDV 制備品的開拓者是 Stro-hmaier,。目前,，在生產中用切向流超濾裝置或中空纖維過濾系統(tǒng)或震動篩進行濃縮。選擇質量優(yōu)良的超濾系統(tǒng)是重要的,，必須嚴格保證超濾系統(tǒng)的無菌,，同時定期檢查和更換濾芯確保純化濃縮的效果。使用分子質量為 6000（PEG6M） 的 PEG（聚乙二醇 ） 純化時,，能夠充分去除來源于 BHK 疫苗中引起過敏反應的物質,。沉淀的抗原用低速離心法獲得，也可用助濾劑進行沉淀抗原的過濾,，如鈣化的硅藻土,，比離心法方便的多。滅活抗原也能用 PEO 沉淀法有效的沉淀,。PEG 沉淀可充分除去變應原成分,，PEO 可使 FMDV 濃縮達 1000倍，從病毒收獲物中最少除去 95 %的雜蛋白質,。

現代 FMD 滅活疫苗與其他動物衛(wèi)生方法合用,，不但可以根除地方性 FMD，還可以抵抗和清除發(fā)生在無 FMD 國家和地區(qū)的 FMD,，研究表明,，疫苗可以迅速的減少接觸傳染，豬,、牛,、羊在接種 3d ～ 5d 內可產生有效免疫應答,。

FMD 在亞洲,、非洲、中東和南美洲的許多國家都有發(fā)生,。絕大多數歐洲國家及部分南美洲國家或地區(qū)通過大量疫苗接種戰(zhàn)役,，在 20 世紀后半葉完成了對 FMD 的控制，收到了顯著成效,。疫苗接種被作為有效預防 FMD 的可靠手段,，目前仍在廣泛應用。例如,，在有 FMD 流行的國家每年都要有計劃地免疫預防接種,；受 FMD 威脅國家除進行嚴格的進口檢疫外，對邊境地區(qū)亦進行定期的疫苗預防接種；無 FMD流行或已消滅了 FMD 的國家在疫苗庫中也儲備了一定數量的戰(zhàn)備疫苗,。構建 FMD 疫苗庫的意義主要有兩個方面,，一是已經消滅 FMD 的發(fā)達國家以此生產應急疫苗作為戰(zhàn)略儲備，應對 FMD 突發(fā)事件,；二是對有可能傳入的 FMDV 新的血清型儲備免疫防控用作戰(zhàn)略疫苗,。因此，研制高質量安全有效的疫苗并不斷改進,，不但是決定疫苗免疫效果的關鍵,，也是成功預防控制直至最終消滅 FMD 的先決條件。

傳統(tǒng)滅活疫苗有良好的功效,，但其也有如免疫期短,、抗原譜窄、滅活不徹底或操作散毒的危險等不足之處?，F在,，許多研究人員正在改進和研究新的滅活疫苗生產工藝，使抗原更純,，佐劑更有效,，滅活更加可靠，通過篩選新的保護劑使疫苗的保存期更長,。因此,，純化濃縮的口蹄疫滅活疫苗在免疫動物后，動物主要產生抗病毒結構蛋白的抗體,，不產生或少量產生病毒非結構蛋白的抗體,。

2 口蹄疫病毒非結構蛋白（Non Structural Protein，NSP）

口蹄疫滅活疫苗成分主要是口蹄疫病毒結構蛋白,，也含有微量的非結構蛋白（Non StructuralProtein,，NSP）?？谔阋卟《镜姆墙Y構蛋白——FMDV的非結構蛋白是指除了衣殼蛋白 1A,、1B、1C,、1D 和它們的前體蛋白之外的所有由病毒編碼但不參與病毒衣殼組成的蛋白,，包括成熟蛋白 L、2A,、2B,、2C、3A,、3B,、3C、3D 以及它們的前體。FMDV 的非結構蛋白 3ABC 多聚蛋白是 NSP 的組成部分,，其合成后被快速裂解為 3A,、3B 和 3C。3A 和 3AB 蛋白有疏水基團,，能把病毒錨定在生物膜上,，便于 RNA 合成。3B 即 VPg 尿苷酸化后,，作為 RNA 的合成引物,。 3C 是蛋白酶，催化聚合蛋白的裂解,。NSP 參與病毒的復制,、多聚蛋白的裂解和病毒顆粒的組裝過程。其中 L 和 3C 能抑制宿主細胞的蛋白合成,，在病毒蛋白的成熟裂解過程中作為蛋白酶裂解聚蛋白,；2A 為 P1/2A 間裂解提供識別序列；2BC,、2C,、3AB 和 3CD形成復制復合物，為病毒 RNA 的合成創(chuàng)造條件,，而且與裝配有關,。與結構蛋白相比，非結構蛋白的變異較少,，相對保守,。口蹄疫滅活疫苗中的非病毒蛋白可引起變態(tài)反應,，另外伴隨病毒增殖而產生的病毒非結構蛋白對于動物感染源的鑒別亦帶來困難,。

3 評價口蹄疫疫苗純度——監(jiān)測非結構蛋白抗體

OIE 動物衛(wèi)生法典規(guī)定：在暴發(fā)后恢復無 FMD 狀態(tài)的標準是，如果使用疫苗的話,，應檢驗接種疫苗動物的 NSP 抗體,。同樣，無 FMD 和接種疫苗的國家,，必須通過證明接種疫苗動物沒有由于感染產生的 NSPs 抗體,。因此，應當純化可以在這些環(huán)境中使用的配方疫苗所使用的 FMD 抗原,，以減少 NSP 含量。用現在的制造技術能夠去除大部分 NSPs,，為的是它們如果有的話,，誘導一點點 NSPs 特異性抗體。在這些情況下，NSP 抗體的檢測能夠提供接種疫苗動物 已經暴露于 FMDV 的證據,?？傊兓瘽饪s FMD 抗原,，以減少 NSP 含量,，同時降低疫苗中非病毒蛋白引起的變態(tài)反應，是控制疫苗質量的關鍵步驟之一,。

盡管現代疫苗生產的工藝已經很高,，但 FMD 疫 苗仍含有痕跡量的 NSP，免疫特別是多次重復免疫之后,，痕跡量的 NSP 蛋白可能刺激機體產生抗體,，但除 3D 外，其他 NSP 抗體水平很低,。OIE 建議,，通過檢測接種至少兩次口蹄疫疫苗的動物血清，是否產生非結構蛋白抗體,，來評價疫苗的純度,。 OIE 推薦的能夠使用的檢驗方法是：用含有最大數目的毒株和主管當局允許的抗原量試驗疫苗的混合物接種不低于 8 頭幼稚牛。牛應當接種疫苗至少 3 次,，間隔 21d ～ 30d,，然后，在每次重復接種疫苗前檢驗,，在最后一次接種疫苗后 30d ～ 60d,， 檢驗 NSPs 抗體。

非結構蛋白（NSP）抗體檢驗,，重組 FMDVNSPs（如 23A,，3B，2B,，2C,，3ABC）表達的抗體用各種能夠通過不同的 ELISA 形式或免疫印跡來測量，即間接酶聯(lián)免疫吸附試驗和酶聯(lián)免疫電轉移印跡試 驗（EITB）,。這些 ELISAs 或用提純的抗原直接地吸附在微量板上,，或用來自半-純化制品 PAbs 或 MAbs 來捕獲特異的抗原。Panaftosa 使用的篩選指數的方法已經證明：其他的間接和競爭 ELISA 檢測牛 3ABC 抗體有相等的診斷性能的特性,。這個同樣的研究進一步確證了來自Panaftosa 初步的資料,，這個資料表明：這些試驗的診斷性能的特性在牛、綿羊和豬上都是有相似的,。EITB 試驗在南美已經廣泛地用作對在前文描述的標準篩選方法的確證試驗,。更詳細的資料可以從泛美衛(wèi)生組織/世界衛(wèi)生組織（PAHO/WHO）PanaftosaOIE 參考實驗室獲得,。 美國率先推出了 FMDV 非結構蛋白ELISA診斷試劑盒，在許多國家和地區(qū)進行區(qū)域性試驗,，并在美國,、阿根廷和中國臺灣省申請了專利。Bergmann 用 OIE 參考方法 3ABC-I-ELISA 檢測臨床持續(xù)性感染牛和亞臨床感染牛的敏感性低于 97%,，他分析這種現象與奶牛處于高免疫抗體水平的壓力,、暴露于病 毒的時間太短等因素有關。因此,，單一的 NSP-ELISA 在免疫牛群中檢測不到 NSP 抗體,，并不能完全代表此牛群無攜帶者。針對這種情況,，各國學者提出了如下解決辦法：

（1）配合使用 3ABC-ELISA 和 EITB,，前者用于篩查，后者用于確診,。

（2）采用 2 種或 2 種以上 ELISA 方法以獲得臨床檢測上的高度敏感性和特異性,。

（3）采取咽/食道分泌物（O/P 液）進行病毒分離和 PCR 檢測及檢測唾液 IgA 抗體綜合確診持續(xù)性感染動物。

（4）采用新型診斷技術如液相微陣列技術檢測多種NSP 抗體,。

眾所周知,，感染口蹄疫病毒動物的 NSPs 抗體為陽性，免疫非純化疫苗也會產生 NSPs 抗體陽性,，這種情況對區(qū)分感染與免疫造成干擾,，同時影響免疫效果。國內有研究通過實驗可以證明高度純化口蹄疫疫苗免疫動物后 NSPs 抗體為陰性,。因此,，提高疫苗純化效果和相應的 NSPs 抗體檢測方法結合使用，可以為將來區(qū)分感染與免疫群組提供數據支持,，為口蹄疫防控及凈化起到積極作用,。

綜上所述，疫苗生產廠家將“疫苗不誘導一個或一個以上 NSPs 的抗體,，和能與相應的診斷方法結合使用”成為研究目標,。高效滅活疫苗免疫動物體內應該沒有病毒非結構蛋白 3ABC 抗體產生，在現代疫苗加工過程中,，2C,、3A、3B 和 3C 等非結構蛋白應被去除,，因此免疫動物體內不會產生針對 NSP 的抗體,，只會誘導產生針對病毒衣殼蛋白的抗體?？傊?，不同檢測方法相結合并使用高效的新型疫苗,，給預防和消滅 FMD 帶來希望,。