自然流產(chǎn)病因很多,，其中染色體異常是引起胚胎停育及自然流產(chǎn)的重要原因。明確流產(chǎn)組織的染色體異常,，對于明確本次流產(chǎn)的原因,，有針對性采取孕期優(yōu)生措施，特別是對于有多次流產(chǎn)史的夫婦,，明確流產(chǎn)的病因,，指導(dǎo)下一次妊娠具有重要的意義。遺傳學(xué)檢測方法多種多樣,，各有優(yōu)勢,。近年來發(fā)展起來的一系列檢測方法增加了染色體檢測的成功率及準確性。本文就流產(chǎn)組織的檢測方法優(yōu)缺點進行簡要綜述,。

    流產(chǎn)指妊娠不足28 周,，胎兒體重不足1 000 g而中止妊娠者，可分為自然流產(chǎn)和人工流產(chǎn),。自然流產(chǎn)的發(fā)生率為10 % ～ 15 %，多數(shù)情況下是由胚胎染色體異常所造成的,。文獻報道,，妊娠＜ 12 周的流產(chǎn)中，50 %為胚胎染色體因素引起,，而中期妊娠流產(chǎn)中仍有1 /3 是由胚胎染色體異常引起［1］,。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指連續(xù)≥2 次的自然流產(chǎn)，其中約有50 %～ 60 %為胚胎染色體異常［2］,。染色體異常的類型包括染色體數(shù)目異常和染色體結(jié)構(gòu)異常,。自然流產(chǎn)中的染色體異常絕大多數(shù)為數(shù)目異常,，約86 %，結(jié)構(gòu)異常為6 %,，染色體嵌合占8 %,。最常見的染色體異常為16、18,、21 三體和X 染色體異常［3］,。因此，流產(chǎn)后絨毛遺傳學(xué)的檢出具有至關(guān)重要的作用,。傳統(tǒng)的絨毛染色體分析為常規(guī)的G 顯帶染色體核型分析,，因其培養(yǎng)失敗率高，分辨率較低,，隨后發(fā)展起來的一系列分子診斷技術(shù)極大地提高了絨毛染色體的分辨率和檢測的成功率,。本文就目前流產(chǎn)后絨毛染色體遺傳學(xué)幾種分析方法進行簡要綜述。
1 G 顯帶染色體核型分析
    細胞染色體核型分析是判斷染色體異常的金標準,，它能直觀地檢查染色體的數(shù)目異常以及5Mb
以上的結(jié)構(gòu)異常,。流產(chǎn)的絨毛組織進行核型分析成功的關(guān)鍵取決于制備出的染色體質(zhì)量，而絨毛染色體的制備受培養(yǎng)方法,、胚胎停育的時間以及從胚胎死亡到自然流產(chǎn)或清宮間隔時間的長短影響,。
從1983 年意大利學(xué)者Simoni 等［4］首次采用絨毛細胞直接制備染色體以來，為提高其培養(yǎng)成功率,，國內(nèi)外學(xué)者對絨毛細胞體外培養(yǎng)方法進行了許多探索,，目前主要是短期培養(yǎng)法、長期培養(yǎng)法,、原位培養(yǎng)法,。
    直接法制備收獲的是細胞滋養(yǎng)層中的朗漢氏細胞，屬于上皮細胞,，只需要幾小時處理即可得到
中期細胞,，方法快速便捷，但是制備的染色體質(zhì)量差,，中期分裂相較少,，形態(tài)不佳，只能滿足染色體計數(shù)的需要,，影響顯帶和核型分析,，無法進行滿意的染色體結(jié)構(gòu)分析，同時嵌合體的診斷受到影響［5］,。
    但該方法不易有母體細胞污染發(fā)生,，且成本較低。絨毛培養(yǎng)法在培養(yǎng)過程中可以得到大量的中
期細胞,，制備的染色體質(zhì)量好,，中期分裂相相對較多,，形態(tài)好，有利于核型分析,，并且出現(xiàn)胎盤局限性嵌合體現(xiàn)象明顯少于直接制備法,，其中短期培養(yǎng)法培養(yǎng)時間相對較短，1～ 2 d,，但是培養(yǎng)出來的是將來發(fā)育成胎盤的細胞滋養(yǎng)層細胞,，并且引起母體細胞污染的可能性有所增加。而長期培養(yǎng)法培養(yǎng)周期相對較長,，大約8 ～ 14 d,，但是培養(yǎng)的細胞主要為胚外中胚層間質(zhì)細胞，將來發(fā)育為胎兒部分,，所獲得的核型更能準確反映胎兒的核型,，較少出現(xiàn)假嵌合體現(xiàn)象［6］。
    目前對于直接法和培養(yǎng)法染色體制備成功率報道不一,。一項關(guān)于對直接法和培養(yǎng)法絨毛染色
體制備成功率的研究中,，直接法與培養(yǎng)法比較無明顯差別，均＞ 97 %,，但染色體檢查培養(yǎng)法優(yōu)于直接法［7］,。而另外一項關(guān)于兩者之間的比較，培養(yǎng)法成功率( 44. 2 %) 明顯較直接法( 34. 3 %) 高［8］,，可能與不同實驗室設(shè)備及技術(shù)條件不同有關(guān),。原位培養(yǎng)法較之前方法省去了細胞轉(zhuǎn)移、離心等步驟,，減少了細胞的丟失及損傷,，不傳代而直接收獲指數(shù)增殖期細胞，經(jīng)染色體制備,，可使最終得到的可供分析的核型較多,，可靠地反映原始細胞的遺傳性狀，故準確性較高,。2010 年一項研究53 例流產(chǎn)絨毛組織原位培養(yǎng)成功51 例( 96. 2 %) ,， 51 例中異常31 例( 60. 8 %) ［9］。雖然原位法制得的絨毛染色體核型可以有效避免消化法制備過程中由于消化,、離心等造成的細胞克隆不完整［10］,。但可能會導(dǎo)致核型分散不良，以致于后續(xù)核型分析困難甚至無法分析,。
    早孕7 ～ 10 周的絨毛細胞發(fā)育良好，11 周以后,，蛻變絨毛增多,，致核分裂相減少,，染色體形態(tài)不佳，增加了核型分析的難度,。如果胚胎在母體內(nèi)死亡時間較長或清宮較晚,，則胚胎枯萎，絨毛細胞發(fā)生變性,，培養(yǎng)成功率將降低［11］,。
    染色體核型分析因培養(yǎng)法受無菌條件限制，有母源性污染的可能,，且對于微缺失和微重復(fù)特別是不平衡易位的微結(jié)構(gòu)異常不易被發(fā)覺,，但是染色體核型分析可以檢測出染色體平衡易位、倒位等,，這是后續(xù)檢測手段都無法檢測出來的,。
2 熒光原位雜交
    熒光原位雜交( Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH) 是在20 世紀80 年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術(shù),，以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法,。采用直接或間接熒光標記的DNA 特異性探針與變性后的染色體、細胞,、組織中的靶核酸序列按照堿基互補配對原則進行雜交,，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下檢測，是一種結(jié)合了細胞遺傳學(xué),、分子生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)的新技術(shù),。
    FISH 檢測成功率高，2002 年后陸續(xù)有大樣本研究報道了FISH 的成功率約為95 % ～ 98 %［12］,。FISH 技術(shù)快速方便,，檢出染色體數(shù)目異常一般僅僅需要24 ～ 48 h［13］。對同一標本可以同時進行多個探針雜交,，不同的探針可以顯示不同的熒光顏色,。
    Pergament 等認為，如果以染色體數(shù)量改變來定義染色體異常,，那么FISH 能檢測出96 % 以上的染色體異常,。因此，F(xiàn)ISH 快速診斷的優(yōu)勢在于檢測染色體數(shù)量上的異常,。
FISH 所使用的試劑以及探針費用都較高,。
     FISH 應(yīng)用一種探針一次只能檢測出一個已知的染色體異常，不能一次性地分析所有染色體,，所以對于那種同時存在的多種染色體異常就需要使用多個探針進行檢測,，這樣就導(dǎo)致FISH 檢測染色體異常的費用較高，不容易將染色體某些結(jié)構(gòu)性異常如易位,、倒位等檢測出來,。由于FISH 用于快速產(chǎn)前診斷主要針對13,、18、21,、X 和Y 染色體,，對其檢測效能如檢出率、敏感度,、特異度等評價也主要是針對這5 種染色體的檢測而言,。
    常規(guī)FISH 檢測相對于染色體核型分析，免去了細胞培養(yǎng),、離心等繁瑣步驟,，但仍需要肉眼識別熒光顯微鏡下的雜交細胞核，會帶有一定的主觀性,。近年來針對產(chǎn)前診斷的FISH 技術(shù)又有了新的發(fā)展,，包括多色熒光原位雜交( M － FISH) 等，用5 種熒光染料標記的24 種不同人類染色體雜交,，可以檢測人類24 條染色體,。2001 年Jalal 等［14］報道M －FISH 可以成功的檢測t( 9，11) ,、t( 8,， 22) 、t( 12,，21)和t( 11,，14) 四種染色體平衡異位，但是由于設(shè)備價格較高,，檢測費用貴,，對微小的移位檢測能力有限，現(xiàn)一般僅用于科研,。
    2002 ～ 2005 年Mayo clinic cytogenetic［15］實驗室進行的一項包含了5 555 例流產(chǎn)樣本的研究中,，4 187 例進行絨毛染色體檢測，其中成功培養(yǎng)的有3 361 例( 80 %) ,，828 例進行絨毛染色體培養(yǎng)失敗,，約20 %對于包括絨毛染色體培養(yǎng)失敗的727 例在內(nèi)共有762 例用FISH 檢測成功，占95 %［13］,。
3 熒光定量PCR
    熒光定量PCR( Quantitative Fluorescent PolymeraseChain Ｒeaction,，QF － PCR) 在二十世紀90 年代初開始應(yīng)用于染色體異常的檢測，最早是在1993 年用于唐氏綜合征的快速產(chǎn)前診斷,。它是通過對相應(yīng)染色體上多態(tài)性的短串引言聯(lián)重復(fù)序( short random repeats,，STRs) 進行擴增，從而對染色體拷貝數(shù)目進行判斷的一種有效方法。操作簡便自動化,，耗時少,，對樣本量要求少，整個檢測過程短,，對工作人員要求較低，價格相對便宜,，1 ～ 2 個工作日可以出報告［16］,。QF － PCR 利用遺傳性標記STR 位點辨別額外染色體的來源，排除母血污染情況［17］,。在診斷常見非整倍體方面,，與傳統(tǒng)的核型分析相比，QF －PCR 和FISH 都是檢測染色體非整倍體的重要方法,，QF － PCR 還能檢出約20 % ～ 30 %的嵌合體,，低于10 % ～ 15 %的嵌合體常不能診斷［18 － 19］，但是仍然不能檢測大多數(shù)染色體結(jié)構(gòu)異常,，并且QF － PCR每次只能對1 個或幾個已知染色體異常的位點進行檢測,，無法進行全基因組范圍篩查和未知的染色體異常的檢測，所以目前QF － PCR 主要應(yīng)用于產(chǎn)前診斷較多,。
    Jutta Jenderny［20］在2014 年發(fā)表的一篇關(guān)于包含534 例稽留流產(chǎn)患者染色體核型分析結(jié)果報道,，常規(guī)染色體分析中144 例培養(yǎng)失敗，其中27 例采用QF － PCR 檢測,，發(fā)現(xiàn)其中8 例有染色體異常,。作者認為QF － PCR可以作為常規(guī)染色體核型分析的補充方法。2008 年Zou Gang［21］的一項關(guān)于61 例稽留流產(chǎn)患者中QF － PCR 檢測成功率為98. 3 %,，檢測結(jié)果與常規(guī)染色體核型分析相符合率為95 %,。
4 多重鏈接探針法
    多重鏈接探針法( multiplex ligation － dependent probe amplification，MLPA) 技術(shù)是2002 年荷蘭科學(xué)家Schouten 等［22］發(fā)明的一種針對靶核酸序列進行定性和定量分析的技術(shù),。針對染色體的特異性序列設(shè)計若干探針,，探針和樣本DNA 上的目標序列雜交，隨后的延伸反應(yīng)中形成每個目標序列的拷貝,，經(jīng)多重PCＲ 擴增,，用序列電泳儀電泳后分析得出結(jié)果。其優(yōu)點是: ① 分辨率高,，探針具有非常短的識別序列,，可以檢測出單一外顯子的拷貝數(shù)的改變，分辨率在50 ～ 70 bp,。② 時間短,，DNA 提取至結(jié)果分析僅需1 ～ 2 個工作日，每次反應(yīng)可同時對多達30 ～ 50 目標位點的缺失、重復(fù),、單核苷酸多態(tài)性等進行檢測,。其操作相對簡單，設(shè)備自動化程度高,，具有快速,、高通量的優(yōu)勢，可同時檢測幾十個樣本［23 － 26］,。
    但是MLPA 探針設(shè)計耗時,，不能對全基因組檢測，不能用于單個細胞檢測,，不同的MLPA 試劑盒針對不同的染色體設(shè)計了不同的探針,，所以檢測所用的試劑盒不同，僅能用MLPA 檢測出實驗試劑盒所用探針所指示的位點,，也就是說無法檢測未知位點的缺失,、重復(fù)或突變，同樣也不能用于染色體平衡易位檢測［27］,。
    2014 年一項樣本量為347 例對比MLPA 和傳統(tǒng)染色體培養(yǎng),，MLPA 檢測成功率為100 %，而傳統(tǒng)培養(yǎng)法染色體檢測失敗率為11. 7 %,，其中MLPA 中有49 例( 5. 2 %) 的染色體異常因為平衡易位,、多倍體、嵌合體而未被診斷出來［28］,。另外一項關(guān)于對比MLPA 技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)法284 例的研究中,，培養(yǎng)失敗50 例，約為18 %,，而對于MLPA 檢測僅有4 例( 1 %) 檢測失敗,，其中3 例是因為樣本質(zhì)量問題，1例因為DNA 量太少［29］,。
5 染色體微陣列分析
    染色體微陣列分析( chromosomal microarray analysis,，CMA) 技術(shù)可分為兩大類: 基于微陣列的比較基因組雜交( array based comparative genomic hybridization，array － CGH) 技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性微陣列( single nucleotide polymorphism array,，SNP － arrary)技術(shù),，CMA 對非整倍體和不平衡性染色體重排的檢出效率與傳統(tǒng)核型分析方法相同，并具有更高的分辨率和敏感性,，尤其對染色體組微小缺失,、重復(fù)等不平衡重排具有突出優(yōu)勢，且無需制備中期染色體［30］,。
    aCGH 較傳統(tǒng)的CGH 分辨率高,，傳統(tǒng)的CGH是在FISH 基礎(chǔ)上建立起來的一種分子細胞遺傳學(xué)技術(shù),，它通過單一的一次雜交可對整個基因組的染色體拷貝數(shù)量的變化進行檢查。其分辨率低,，約3～ 10 MB［31 － 32］,，array － CGH 采用與待測樣本相同性別的健康人DNA 或男、女性健康人混合DNA 作為參照DNA,，利用熒光素分別標記參照DNA 和待測DNA,，然后與探針進行雜交，獲得定量的拷貝數(shù)檢測結(jié)果,，該方法分辨率為300 kb［33］,。aCGH 技術(shù)使用的探針較長，其優(yōu)勢在于用戶可根據(jù)需要設(shè)計并制作芯片,，可針對特定區(qū)域設(shè)計高密度探針，以增加在該區(qū)域的檢測靈敏度和特異性,。
    SNP array 與array － CGH 相比,，二者不同之處在于方法學(xué)。SNP array 無須將對照樣本和待測樣本分別標記,，將待測樣本進行雜交,，只需將待測樣本DNA 與一整套正常基因組對照資料進行對比,，計算機將每個探針熒光信號強度的數(shù)字信息與一個參考生物信息文件的信息進行比較計算即可獲得診斷結(jié)果,，SNP array 通過高密度的探針增加了檢測的分辨率。另外SNP array 上的探針除了帶有拷貝數(shù)信息外,，還帶有SNP 分型的信息,，可用以檢測雜合子缺失，而臨床上利用雜合子缺失的信息可以對部分隱性遺傳病及印記基因疾病進行檢測［34］,。
    CMA 檢測樣本量需求小,，僅需要很少量的細胞或組織提取，并且該方法既可用于新鮮標本也可用于陳舊或凍存標本的診斷,，因而用于自然流產(chǎn)的診斷尤為適宜,。該技術(shù)通過一次性雜交達到全基因組分析，根據(jù)需要可以檢測出小于1 kb 染色體的微缺失和微重復(fù),，并且對非平衡染色體結(jié)構(gòu)重排診斷的準確性高,，檢測周期僅需2 ～ 3 d［35］。
    但是CMV 不能檢測出多倍體及其他染色體平衡結(jié)構(gòu)重排例如異位,、倒位和低水平的嵌合體［36］,，檢測出來的無意義的CMV 對患者及家屬造成不必要的焦慮，并且aCGH 無法檢測三倍體［37］,，較其他染色體檢測手段,，CMV 價格比較貴,。
6 高通量基因測序
    以第二代測序技術(shù)( next － generation sequencing technology) 為代表的高通量測序技術(shù)，具有分辨率高,、敏感性高和準確性高,、成本低、方法靈活等優(yōu)點,，通過對全基因組覆蓋性檢測,，檢測拷貝數(shù)變異( copy number variation，CNV) ,，可以發(fā)現(xiàn)染色體片段的微缺失和微重復(fù),，從而得到更為準確的基因變化信息。通過對測序深度的改變,，可以最小檢測到10 kb的CNV 改變,。常規(guī)染色體核型分析時，母體細胞污染( maternal cell contamination,，MCC) 常常會影響檢測結(jié)果,，高通量測序技術(shù)可以通過采集母親血液驗證結(jié)果，來排除MCC 的影響［38］,。對檢測標本要求低,，對污染、蛻化的絨毛也可進行檢測,，但并不能發(fā)現(xiàn)染色體平衡易位,，并且費用較高，目前僅用于染色體非整倍體的快速檢測,。
    2014 年劉惠蓮［38］的一項關(guān)于44 例稽留流產(chǎn)絨毛染色體高通量基因測序結(jié)果顯示組織檢測成功率為100 %,，其中異常檢出率為66. 3 %，高通量基因測序技術(shù)檢測結(jié)果與傳統(tǒng)染色體核型分析結(jié)果一致,，其中染色體核型分析培養(yǎng)失敗的1 例,，高通量基因測序提示性染色體三體。蔡莉蓉［39］2014 年的一項關(guān)于14 例高通量測序技術(shù)在自然流產(chǎn)絨毛樣本中檢測結(jié)果和絨毛染色體常規(guī)分析相比,，絨毛染色體常規(guī)分析正常中6 例提示有CNV 的改變,，占43 %，最小能檢測到250 kb 片段的改變,。
7 BACs － on － Beads
    近年來已有利用BACs － on － Beads ( bacterialartificial chromosome on beads,，BoBs) 技術(shù)進行染色體檢測的報道。BoBs 技術(shù)利用微珠為載體進行多重陣列測定,，從已知的細菌人工染色體( bacterial artificial chromosome,，BAC) 上獲取聚合酶鏈反應(yīng)( polymerase chain reaction，PCＲ) 產(chǎn)物,，將其標上特異的熒光信號,，作為雜交探針,，固定在微珠上，通過將樣本DNA 與BAC 來源的探針微珠雜交,，可以檢測基因組上遺傳物質(zhì)的缺失或重復(fù),，一次性檢出24條染色體的非整倍體改變［40］。除了針對流產(chǎn)組織設(shè)計的BoBs 試劑盒以外,，針對產(chǎn)前診斷BoBs 試劑盒可以檢測染色體非整倍體改變和9 個微缺失區(qū)域的微缺失綜合征,。
    BoBs 技術(shù)較為簡單，儀器成本低,，通量高,，每個反應(yīng)可檢測多份樣本，較FISH 和CMV 價格較低,，平均2 ～ 3 d 即可出報告,，但由于方法設(shè)計的局限性，BoBs 技術(shù)不能檢測多倍體和微缺失綜合征,。但是BoBs 技術(shù)是最近發(fā)展起來的染色體檢測手段,，目前還未被廣泛使用。
    明確流產(chǎn)物的遺傳學(xué)診斷可以為明確遺傳因素在本次流產(chǎn)中所起的作用,，對下次妊娠采取有針
對性的孕前優(yōu)生措施，對于不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者,，明確流產(chǎn)物的遺傳學(xué)檢測有助于尋找可能的遺傳學(xué)因素和父母雙方遺傳學(xué)異常的線索,。必要時為下次妊娠進行植入前診斷/產(chǎn)前診斷提供遺傳學(xué)依據(jù)。

參考文獻略