大多數(shù)人類遺傳病是由于點突變---DNA序列上的單個堿基錯誤---導致的,。然而，當前的基因組編輯方法不能夠高效地校正細胞中的這些突變,，而且經(jīng)常導致隨機的核苷酸插入或刪除（insertions or deletion,， indel）。

如今,，在一項新的研究中,，來自美國哈佛大學的研究人員對CRISPR/Cas9技術進行改進，構建出一種新的“堿基編輯器（base editor）”,，并且避免這些問題的發(fā)生,。在人細胞系和小鼠細胞系中，這種堿基編輯器永久性地和高效地將堿基胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為堿基尿嘧啶（U）,，同時具有較低的編輯錯誤發(fā)生率,。相關研究結果于2016年4月20日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標題為“Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”,。

美國加州大學伯克利分?；蚪M學創(chuàng)新計劃科學主任Jacob Corn（未參與者這項研究）說，“在人體的任何一個地方,，都有大量的遺傳病存在,，這些遺傳病本質(zhì)上是由于堿基換入或換出,。”

在此之前,，CRISPR/Cas9基因組編輯方法一直依賴于一種被稱作同源重組修復（homology-directed repair）的細胞機制,，其中這種修復是由基因組DNA上的雙鏈斷裂觸發(fā)的?？茖W家們給細胞導入一種含有目標序列的DNA模板,，并利用酶Cas9在這種細胞的基因組靶位點上進行切割，導致基因組發(fā)生雙鏈斷裂,，然后等待一段時候后觀察這種同源重組修復是否將這種模板整合到基因組中,，將雙鏈重新連接在一起。不幸的是,，這種方法是低效率的（整合很少發(fā)生）,，而且經(jīng)常在斷裂點附近以隨機indel的形式引入新的堿基錯誤，從而使得它不適合用于點突變的治療性地校正,。

因此,，在哈佛大學化學家和化學生物學家David Liu的領導下,，研究人員嘗試了一種不同的方法,。首先，他們讓Cas9部分失活,，使得它不能夠在細胞基因組上產(chǎn)生雙鏈斷裂,。他們?nèi)缓笞孋as9與一種被稱作胞苷脫氨酶的酶偶聯(lián)在一起，這樣就可在不用切割DNA的情形下,，直接催化C變成U（本質(zhì)上等同于胸腺嘧啶T）,。將這種偶聯(lián)物導入細胞中，會在細胞基因組靶位點上產(chǎn)生一對錯配的堿基對：一條鏈上新產(chǎn)生的U與另一條鏈上初始堿基G錯配,。Liu解釋道,，“這種[錯配]讓DNA發(fā)生扭曲。它在DNA上產(chǎn)生一個有趣的但看起來并不正常的小凸起,?！?/p>

這種凸起觸發(fā)一種不同的細胞修復機制，即錯配修復,，這個修復機制移除錯配堿基對（U-G）中的一個,，然后用與剩下的堿基互補的堿基進行替換。在不知道哪個堿基是正確的情形下,，錯配修復產(chǎn)生所需的G→C轉(zhuǎn)換的概率是50%,，另外，U→C轉(zhuǎn)換的概率也是50%,。

但是當模板信息可獲得時,，錯配修復確實還會進一步整入這種信息：它檢測到DNA骨架上被稱作缺口的小片段斷裂,。Liu說，“細胞已進化出錯配修復機制來優(yōu)先考慮舊有的DNA鏈而不是新合成的DNA鏈,。新合成的DNA鏈往往存在一些缺口,。因此，我們有理由相信我們可能能夠操縱錯配修復來偏好地校正我們不想要的DNA鏈,，也就是含有G的那條DNA鏈,。”

研究人員為此再次對Cas9進行基因改造,，這次改造的目的在于讓它能夠在不進行基因編輯的含G的DNA鏈上產(chǎn)生缺口,，同時讓需要進行基因編輯的含U的DNA鏈保持完整。Liu說,，“這時,，細胞會說，‘哈,，這里存在一個堿基錯配,，發(fā)生錯誤的堿基肯定是G，這是因為含G的DNA鏈存在缺口,，而被細胞認為是新合成的DNA鏈,。’它將偏好地對堿基G進行校正,，同時校正時利用另外一條鏈作為模板,。”

通過在人細胞的基因組中的6個位點上使用這種技術,，研究人員報道,，正確的堿基校正率高達37%，同時只有1%左右的序列發(fā)生indel,。相反,，在其中的三個位點上，利用正常的Cas9編輯技術進行測試,，正確的校正率不到1%,，而且4%以上的序列發(fā)生indel。研究人員還利用這種技術在小鼠細胞中將與阿爾茨海默病相關聯(lián)的APOE基因的一個高風險變異體轉(zhuǎn)換為低風險的基因版本,，證實了這個技術校正疾病相關性突變的潛力,。

Corn說，“通過對這種Cas9進行基因改造,，他們找到一個非常好的方法誘騙細胞偏好選擇它通常并不偏好選擇的修復途徑,。”然而,，他提醒道,，由于這種方法當前只能夠?qū)A基對C-G轉(zhuǎn)化為U-A（亦即T-A）,，而且在一些情形下，它還會對與靶位點靠得很近的其他堿基C進行編輯,，“因此,，它當然不是靈丹妙藥。這并不意味著你如今能夠治療每種遺傳病,。但是很可能將有不少遺傳病可利用這種方法加以治療,。”

英國牛津大學Tudor Fulga將這種技術稱為“一種構思非常巧妙的想法”,，可以規(guī)避低效率的同源重組修復和降低不想要的indel產(chǎn)生,。他告訴《科學家》雜志，“我認為這將會在這個領域引發(fā)觀念轉(zhuǎn)變,。這種基于Cas9的堿基編輯方法很可能會產(chǎn)生非常巨大的影響,，不論是在解答基礎研究問題的情形下，還是在基于基因組改造的治療應用方面,?！?/p>

與此同時，還有兩篇文章同一天出現(xiàn)在線Nature期刊上,。這兩篇文章都涉及Cas9的一種潛在替代者：Cpf1酶,。CRISPR/Cpf1在細胞基因組靶位點上進行切割，產(chǎn)生“粘性末端（sticky end）”---切割的DNA上存在的突出末端,，在DNA雙鏈斷裂位點的兩邊留下未配對的堿基---而不是利用Cas9切割DNA雙鏈產(chǎn)生的平頭末端（blunt end）,。

在其中的一篇文章中,，來自德國馬克斯普朗克感染生物學研究所的Emmanuelle Charpentier和同事們證實不同于Cas9,，Cpf1除了切割DNA外，還對RNA進行加工,。相關研究于2016年4月20日在線發(fā)表在Nature期刊上,，論文標題為“The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA”。

在另外一篇文章中,，來自中國哈爾濱工業(yè)大學生命科學與技術學院的黃志偉（Zhiwei Huang）教授和同事們解析出CRISPR/Cpf1的晶體結構,。相關研究于2016年4月20日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標題為“The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA”,。

黃教授告訴《科學家》雜志,，“在細胞中進行DNA修復時，粘性末端要比[平頭末端]更加高效,。我們認為[理解] Cpf1的結構將有助我們不僅知道Cpf1的工作機制,，而且也有助設計更加特異性的和更加高效的基因組編輯工具?！?/p>

原始出處：

Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage

doi:10.1038/nature17946

The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA

doi:10.1038/nature17945

The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA

doi:10.1038/nature17944