|
一,、光學(xué)顯微鏡
顯微鏡的發(fā)明和使用，使得人類可以從植物的組織和細(xì)胞層次揭示植物的奧秘,，認(rèn)識植物的生命活動規(guī)律,。隨著顯微鏡的不斷改進和提高，出現(xiàn)了適應(yīng)于不同需要的各種特殊顯微鏡,。光學(xué)顯微鏡技術(shù)是經(jīng)典的技術(shù),，迄今仍然是研究植物細(xì)胞和組織的重要技術(shù)。
?。ㄒ唬┢胀ü鈱W(xué)顯微鏡
普通光學(xué)顯微鏡是最常用的光學(xué)顯微鏡,，它以透射光作為照明光源，又稱明視野顯微鏡,。其他許多種類的顯微鏡都是在此基礎(chǔ)上,，根據(jù)光學(xué)的現(xiàn)象和規(guī)律，適當(dāng)?shù)馗难b而成,。
1 .基本原理 顯微鏡通過透鏡放大被檢物體,，其成像原理和光路圖如圖3-1所示。被檢物體AB放在物鏡（L1）前方的1～2倍焦距之間,，則在物鏡（L1）后方形成一個倒立的放大實像A1B1,，這個實像正好位于目鏡（L2）的焦點之內(nèi)，通過目鏡后形成一個放大的虛像A2B2,。這個虛像通過調(diào)焦裝置使其落在眼睛的明視距離處,，使所看到的物體最清晰，也就是說虛像A2B2是在眼球晶狀體的兩倍焦距之外,，通過眼球后在視網(wǎng)膜形成一個倒立的A2B2縮小像A3B3,。 2. 結(jié)構(gòu)及性能 顯微鏡由光學(xué)系統(tǒng)和機械裝置兩部分組成（圖3-2）。光學(xué)系統(tǒng)主要包括物鏡,、目鏡和照明裝置,，機械裝置主要包括鏡座,、鏡臂、載物臺,、鏡筒,、物鏡轉(zhuǎn)換器和調(diào)焦裝置等。 顯微鏡的主要性能包括分辨力,、放大率,、焦點深度、鏡像亮度和視場亮度等,。分辨力指能夠區(qū)分的相近兩點間的最小距離,，兩點間的距離越小，表示顯微鏡的分辨力越高,。顯微鏡的分辨力可用公式R=0.61λ/(nsinα) 表示,，其中R為分辨力，λ為光波波長,，n為物鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率,，α為透鏡角孔徑，指從位于物鏡光軸上標(biāo)本的一個點發(fā)出光線伸長到物鏡前透鏡的有效直徑的兩端所形成的夾角的一半（圖3-3）,。nsinα又稱鏡口率,。放大率也稱放大倍數(shù)，指最終成像的大小與原物體大小的比值,，顯微鏡的總放大倍數(shù)等于目鏡和物鏡的放大倍數(shù)的乘積,。焦點深度指當(dāng)焦點對準(zhǔn)物體某一點時，不僅位于該點平面上的各點都可看得清楚,，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi),，也能看得清楚，這個清晰部分的厚度就是焦點深度,。焦點深度與總放大率和鏡口率成反比,，因此，高放大率和高鏡口率的顯微鏡其焦點深度淺,，不能看到標(biāo)本的全厚度,，必須調(diào)節(jié)螺旋，仔細(xì)地從上到下進行觀察,。鏡像亮度是顯微鏡的圖像亮度的簡稱，指在顯微鏡下所觀察到的圖像的明暗程度,。使用時,，對鏡像亮度的要求，一般是使眼睛既不感到暗淡,，又不覺得耀眼,。鏡像亮度與鏡口率平方成正比,，與總放大倍數(shù)的平方成反比。視場亮度是指顯微鏡下整個視場的明暗程度,，不僅與目鏡,、物鏡有關(guān)，還直接受聚光鏡,、光闌和光源等因素的影響,。在不更換物鏡和目鏡的情況下，視場亮度大,，鏡像亮度也就大,。 3. 基本應(yīng)用 普通光學(xué)顯微鏡被廣泛地應(yīng)用于各學(xué)科領(lǐng)域中，它是用來觀察,、記錄和研究經(jīng)過制片技術(shù)處理后被檢物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)的最主要的光學(xué)精密儀器,。能夠用這類顯微鏡觀察到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞壁,、紋孔,、線粒體、質(zhì)體,、液泡,、核和核仁等，均稱為細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu),。
?。ǘ┫嗖铒@微鏡
相差顯微鏡是利用特殊的相差裝置，使光波通過樣品時把光程差變?yōu)檎穹?，以增大透明物體的明暗反差,，從而可以用來觀察未染色的活體組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一種顯微鏡。
1. 基本原理 相差顯微鏡的基本原理如圖3-1-4所示,，從光源射出的光通過標(biāo)本時,，如果標(biāo)本是完全均質(zhì)透明的物體，光將繼續(xù)前進,，稱為直射光,；若某部分含有折射率不同的物質(zhì)時，由于光的衍射現(xiàn)象則向周圍側(cè)方分散前進,，這種光振幅較小,，相位延后，稱為衍射光,。當(dāng)直射光和衍射光兩個光波同時達(dá)到一點時,，則相互干涉，形成合成波。合成波的大小取決于兩個光波的振幅和相位差,。如果振幅相等,，相位差為零，其合成波則有兩倍的振幅,，產(chǎn)生相長干涉,，最為明亮；若一個光的相位推遲,，其合成波振幅減小,，光亮變暗；當(dāng)一個光波恰好推遲半個波長時,，則兩個光波的振幅相抵消,，產(chǎn)生相消干涉，成為黑暗狀態(tài),。如果合成波的振幅比背景光的振幅大,，則稱為明反差（負(fù)反差）；如果合成波的振幅比背景光的振幅小,，則稱為暗反差（正反差）,。光線的相位差并不為肉眼所識別，通過光的干涉和衍射現(xiàn)象,，相位差變成了振幅差,，即明暗之差，肉眼因此得以識別,。 2. 結(jié)構(gòu)及性能 與普通光學(xué)顯微鏡相比,，相差顯微鏡在結(jié)構(gòu)上進行了特別設(shè)計，用環(huán)狀光闌代替可變光闌,，用帶相板的物鏡代替普通物鏡（圖3-5）,。相差板是安裝在相差物鏡后面的裝置。相差板分為兩部分,，一是通過直射光的部分,，叫共軛面，通常呈環(huán)狀,，另一部分是繞過衍射光的部分,，叫補償面，位于共軛面的內(nèi)外兩側(cè),。相差板上裝有吸收膜及推遲相位的相位膜,。相差板除推遲直射光或衍射光的相位以外，還有吸收光量使光度發(fā)生變化的作用,。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌,，安裝在聚光鏡下面,，光線只能通過環(huán)狀光闌的透明部分射入。不同倍數(shù)的相差物鏡要用相應(yīng)的環(huán)狀光闌,。光線從聚光鏡下的環(huán)狀光闌的縫隙射入直射光，照射到被檢物體上,，產(chǎn)生直射光和衍射光兩種光波,。在物鏡的后焦面上，設(shè)有相差板,，直射光通過共軛面,，衍射光通過補償面。背景為直射光,，成像為直射光和衍射光的合成波,。 3. 基本應(yīng)用 相差顯微鏡最基本的應(yīng)用是觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，可用新鮮的活材料,，也可用固定材料,，但無論用哪種材料都不宜過厚，一般以不超過20μm,。制作切片所用的載玻片也須講究質(zhì)量,，要均勻一致，厚度在1mm左右,，玻片過厚時,，亮環(huán)就不能與相差板的圓環(huán)一致。
（三）暗視野顯微鏡
暗視野顯微鏡以丁達(dá)爾效應(yīng)為基礎(chǔ),，通過特殊的集光器,，使照射樣品的直射光不能進入物鏡，只有被樣品表面所反射或所衍射的散射光進入物鏡,，因而在黑暗的視野中形成物體明亮的像,。暗視野顯微鏡具有較高的分辨力，它主要被用于觀察未染色的標(biāo)本,。
1. 基本原理 當(dāng)來自集光器的入射光由于斜度的增加落在物鏡的孔徑之外時,，這種光將不能直接參與像的形成。作為在標(biāo)本上折射,、反射和干涉的結(jié)果在各個方向上被散射的光將部分地被物鏡所捕獲,。由于直射光線不能進入物鏡，當(dāng)光路中沒有物體時,，整個視野是完全黑暗的,，因此稱為暗視野。但是如果把一個物體放在光路中時,，它將反射來自照明器的部分光而成為小的光源,。當(dāng)這種物體衍射點的亮度在中間像上足夠強時，它在顯微鏡中將能被分辨。暗視野中的像主要是由在具有不同折射率的界面上產(chǎn)生的散射光形成的,，因此所形成的物體的像是不可靠的,，它不能表示物體的真實結(jié)構(gòu)，它只是勾畫了物體的輪廓,，只能看到物體的存在和運動,。 2. 結(jié)構(gòu)及性能 對于暗視野顯微鏡來說，必須有一個專門的照明系統(tǒng),，這個系統(tǒng)應(yīng)該滿足以下要求：照明光線要有足夠的傾斜度,，以保證沒有直接射入物鏡的光錐；較強的光源,；集光器必須有調(diào)中裝置,。實際上，普通顯微鏡換上暗視野聚光器或用中心擋光法,，即可取得暗視野效果,。就其構(gòu)造來說，常用的暗視野集光器有以下幾種：拋物面聚光器,；心形面聚光器,；明暗兩用聚光器；輝光聚光器,；同心球面聚光器等,。其中以拋物面聚光器最為常用。拋物面聚光器是一個單透鏡,，周圍傾斜度較小的拋物線形式（圖3-6）,。由顯微鏡的反光鏡反射出的光線，被聚光器的中部遮光板所阻擋,，但側(cè)面光線則自由進入遮光板旁和透鏡邊緣之間的縫隙,。這些光線在聚光鏡凹面上發(fā)生折射，結(jié)果光線集中到聚光器的界面以外,，處于觀察標(biāo)本的平面上,。 3. 基本應(yīng)用 暗視野顯微鏡觀察物體時，主要觀察的是物體的幾何輪廓,，分辨不清內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu),，適合于觀察具有規(guī)則結(jié)構(gòu)的物體，例如硅藻,、放線菌等,；或具有線性結(jié)構(gòu)的物體，如鞭毛,、纖維,；以及細(xì)菌,、單細(xì)胞浮游生物、懸浮細(xì)胞等非常微小的生物體,。
（四）熒光顯微鏡
熒光顯微鏡是利用一定波長的光使樣品受到激發(fā),，產(chǎn)生不同顏色的熒光，用來觀察和分辨樣品中某些物質(zhì)及其性質(zhì)的一種顯微鏡,。
1. 基本原理 用于顯微觀察中的熒光可以分為自發(fā)熒光和繼發(fā)熒光,。自發(fā)熒光也稱為原發(fā)熒光，它是指由一個物質(zhì)的自然性質(zhì)所產(chǎn)生的熒光,，如葉綠素在可見光的激發(fā)下會產(chǎn)生紅色熒光。繼發(fā)熒光是由已經(jīng)被結(jié)合到顯微鏡標(biāo)本成分中的具有熒光性質(zhì)的物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光,，如細(xì)胞中的DNA經(jīng)吖啶橙染色后,，就可以發(fā)出黃綠色的熒光。熒光顯微鏡利用一個高發(fā)光效率的點光源,，經(jīng)過濾色系統(tǒng),，發(fā)出一定波長的光作為激發(fā)光，能激發(fā)標(biāo)本的熒光物質(zhì)使其發(fā)出一定的熒光,，通過物鏡和目鏡的放大進行觀察,。在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也容易清晰辨認(rèn),，靈敏度高,。 2. 結(jié)構(gòu)及性能 熒光顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡基本相同，主要區(qū)別是熒光顯微鏡具有熒光光源和濾色系統(tǒng)（圖3-7）,。熒光光源常用的有高壓汞燈和氙燈,。濾色系統(tǒng)由激發(fā)濾光片和阻斷濾光片組成。激發(fā)濾光片放置于光源和物鏡之間,，其作用是選擇激發(fā)光的波長范圍,。阻斷濾光片是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡，防止激發(fā)光干擾熒光和損傷眼睛,，并可選擇特異的熒光通過,，從而表現(xiàn)出專一性的熒光色彩。 3. 基本應(yīng)用 熒光顯微鏡可觀察固定的切片標(biāo)本,，也可在活體染色后進行活細(xì)胞的觀察,。因此，有關(guān)細(xì)胞與組織中物質(zhì)的吸收與運輸,，化學(xué)物質(zhì)的分布與定位等問題,，均可利用這種顯微鏡進行研究。 ?。ㄎ澹┑怪蔑@微鏡
|
|
|
來自： 百眼通 > 《01總論-718》
