中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類

農(nóng)藥殘留量快速檢測(cè)

Rapid determination for organophosphate
carbamate pesticide residues in vegetables

2003-08-11發(fā)布 2004-01-01實(shí)施

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了由酶抑制法測(cè)定蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速篩選測(cè)定,。

速測(cè)卡法（紙片法）

2 原理

膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯（紅色）水解為乙酸與靛酚（藍(lán)色）,，有機(jī)磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶有抑制作用，使催化,、水解,、變色的過(guò)程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中是否有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在,。

3 試劑

3.1 固化有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的紙片（速測(cè)卡）,。

3.2 pH7.5緩沖溶液：分別取15.0g磷酸氫二鈉 [Na2HPO4·12H2O]與1.59g無(wú)水磷酸二氫鉀[KH2 PO4 ]，用500mL蒸餾水溶解,。

4 儀器

4.1 常量天平

4.2 有條件時(shí)配備37℃±2℃恒溫裝置,。

5 分析步驟

5.1 整體測(cè)定法

5.1.1 選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土,，剪成1cm左右見方碎片,，取5g放入帶蓋瓶中，加入10mL緩沖溶液,，振搖50次,，靜置2min以上。

5.1.2 取一片速測(cè)卡,，用白色藥片沾取提取液,，放置10min以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在37℃恒溫裝置中放置10min,。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤(rùn)。

5.1.3 將速測(cè)卡對(duì)折,，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min,，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應(yīng)。

5.1.4 每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖液的空白對(duì)照卡,。

5.2 表面測(cè)定法（粗篩法）

5.2.1 擦去蔬菜表面泥土,，滴2滴～3滴緩沖溶液在蔬菜表面,，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。

5.2.2 取一片速測(cè)卡,，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上,。

5.2.3 放置10min以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在37℃恒溫裝置中放置10min,。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤(rùn),。

5.2.4 將速測(cè)卡對(duì)折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min,，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應(yīng),。

5.2.5 每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖液的空白對(duì)照卡。

6 結(jié)果判定

結(jié)果以酶被有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制（為陽(yáng)性）,、未抑制（為陰性）表示,。

與空白對(duì)照卡比較，白色藥片不變色或略有淺藍(lán)色均為陽(yáng)性結(jié)果,。白色藥片變?yōu)樘焖{(lán)色或與空白對(duì)照卡相同,，為陰性結(jié)果。

對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的樣品,，可用其它分析方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量,。

7 附則

7.1 速測(cè)卡技術(shù)指標(biāo)

7.1.1 靈敏度指標(biāo)：速測(cè)卡對(duì)部分農(nóng)藥的檢出限見表1。

表1 部分農(nóng)藥的檢出限

7.1.2 符合率：在檢出的30份以上陽(yáng)性樣品中,，經(jīng)氣相色譜法驗(yàn)證,，陽(yáng)性結(jié)果的符合率應(yīng)在80%以上。

8 說(shuō)明

8.1 蔥,、蒜,、蘿卜、韭菜,、芹菜,、香菜、茭白,、蘑菇及番茄汁液中,，含有對(duì)酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性,。處理這類樣品時(shí),，可采取整株（體）蔬菜浸提或采用表面測(cè)定法。對(duì)一些含葉綠素較高的蔬菜,，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法,，減少色素的干擾。

8.2 當(dāng)溫度條件低于37℃,，酶反應(yīng)的速度隨之放慢,，藥片加液后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對(duì)延長(zhǎng),，延長(zhǎng)時(shí)間的確定，應(yīng)以空白對(duì)照卡用手指（體溫）捏3min時(shí)可以變藍(lán),，即可往下操作,。注意樣品放置的時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照卡放置的時(shí)間一致才有可比性?？瞻讓?duì)照卡不變色的原因：一是藥片表面緩沖溶液加的少,、預(yù)反應(yīng)后的藥片表面不夠濕潤(rùn)，二是溫度太低,。

8.3 紅色藥片與白色藥片疊合反應(yīng)的時(shí)間以3min為準(zhǔn),，3min后的藍(lán)色會(huì)逐漸加深，24h后顏色會(huì)逐漸退去,。

酶抑制率法（分光光度法）

9 原理

在一定條件下,，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān),。正常情況下,，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng),，產(chǎn)生黃色物質(zhì),，用分光光度計(jì)在412nm處測(cè)定吸光度隨時(shí)間的變化值，計(jì)算出抑制率,，通過(guò)抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在,。

10 試劑

10.1 pH8.0緩沖溶液：分別取11.9g無(wú)水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解,。

10.2 顯色劑：分別取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉,，用20mL緩沖溶液溶解，4℃冰箱中保存,。

10.3 底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿,，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。保存期不超過(guò)兩周,。

10.4 乙酰膽堿酯酶：根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解,，3 min的吸光度變化 D A 0 值應(yīng)控制在0.3以上,。搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫４嫫诓怀^(guò)四天,。

10.5 可選用由以上試劑制備的試劑盒,。乙酰膽堿酯酶的 D A 0 值應(yīng)控制在0.3以上。

11 儀器

11.1 分光光度計(jì)或相應(yīng)測(cè)定儀。

11.2 常量天平,。

11.3 恒溫水浴或恒溫箱。

12 分析步驟

12.1 樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品,，沖洗掉表面泥土,，剪成1cm左右見方碎片，取樣品1g,，放入燒杯或提取瓶中,，加入5mL緩沖溶液，振蕩1 min～2min,，倒出提取液,，靜置3 min ～5min，待用,。

12.2 對(duì)照溶液測(cè)試：先于試管中加入2.5mL緩沖溶液,，再加入0.lmL酶液、0.1mL顯色劑,，搖勻后于37℃放置15min以上（每批樣品的控制時(shí)間應(yīng)一致）,。加入0.lmL底物搖勻，此時(shí)檢液開始顯色反應(yīng),，應(yīng)立即放入儀器比色池中,，記錄反應(yīng)3 min的吸光度變化值 D A 0 。

12.3 樣品溶液測(cè)試：先于試管中加入2.5mL樣品提取液,，其它操作與對(duì)照溶液測(cè)試相同,，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值 D A t 。

13 結(jié)果的表述計(jì)算

13.1 結(jié)果計(jì)算

見式（1）,。

抑制率(%)=[ ( D A 0 - D A t )/ D A 0 ]×100…………………………（1）

式中： D A 0 ——對(duì)照溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值,；

D A t ——樣品溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值。

13.2 結(jié)果判定

結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示,。

當(dāng)蔬菜樣品提取液對(duì)酶的抑制率≥50%時(shí),，表示蔬菜中有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，樣品為陽(yáng)性結(jié)果,。陽(yáng)性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗(yàn)2次以上,。

對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的樣品，可用其它方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量,。

14 附則

14.1 酶抑制率法技術(shù)指標(biāo)

14.1.1 靈敏度指標(biāo)：酶抑制率法對(duì)部分農(nóng)藥的檢出限見表2,。

表2 酶抑制率法對(duì)部分農(nóng)藥的檢出限

14.1.2 符合率：在檢出的抑制率≥50%的30份以上樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗(yàn)證,，陽(yáng)性結(jié)果的符合率應(yīng)在80%以上,。

15 說(shuō)明

15.1 蔥、蒜、蘿卜,、韭菜,、芹菜、香菜,、茭白,、蘑菇及番茄汁液中，含有對(duì)酶有影響的植物次生物質(zhì),，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性,。處理這類樣品時(shí)，可采取整株（體）蔬菜浸提,。對(duì)一些含葉綠素較高的蔬菜,，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾,。

15.2 當(dāng)溫度條件低于37℃,，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對(duì)延長(zhǎng),，延長(zhǎng)時(shí)間的確定,，應(yīng)以膽堿酯酶空白對(duì)照測(cè)試3min的吸光度變化 D A 0 值在0.3以上，即可往下操作,。注意樣品放置時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照溶液放置時(shí)間一致才有可比性,。膽堿酯酶空白對(duì)照溶液3min的吸光度變化 D A 0 值＜0.3 的原因：一是酶的活性不夠，二是溫度太低,。