一,、離心技術(shù)

離心是研究如細(xì)胞核、線粒體,、高爾基體,、溶酶體和微體，以及各種大分子基本手段,。一般認(rèn)為,，轉(zhuǎn)速為10~25Kr/min的離心機稱為高速離心機；轉(zhuǎn)速超過25Kr/min,，離心力大于89Kｇ者稱為超速離心機,。目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100Kr/min，離心力超過500Kg,。

（一）差速離心（differential centrifugation）

在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心,，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器,。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體,、溶酶體與過氧化物酶體,、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體,。由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊,，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)2～3次效果會好一些,。差速離心只用于分離大小懸殊的細(xì)胞,，更多用于分離細(xì)胞器。通過差速離心可將細(xì)胞器初步分離,，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化,。

速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

（二）密度梯度離心（density gradient centrifugation）

用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度,，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部,，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離,。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種（圖2-23）,。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖,。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度,，且密度高時，粘度不高,；2）PH中性或易調(diào)為中性,；3）濃度大時滲透壓不大,；4）對細(xì)胞無毒,。

A等速度沉降，B等密度沉降

1,、速度沉降

速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器,。這種降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度,。生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離,。

2、等密度沉降

等密度沉降（isopycnic sedimentation）適用于分離密度不等的顆粒,。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處,，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離,。等密度沉降通常在較高密度的介質(zhì)中進行,。介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度,，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩,。再者,，這種方法所需要的力場通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速離心,，離心時間也較長,。大的離心力、長的離心時間都對細(xì)胞不利,。大細(xì)胞比小細(xì)胞更易受高離心力的損傷,，而且停留在等密度介質(zhì)中的細(xì)胞比處在移動中的細(xì)胞受到更大的損傷。因此,，這種方法適于分離細(xì)胞器,，而不太適于分離和純化細(xì)胞。

二,、流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是對單個細(xì)胞進行快速定量分析與分選的一門技術(shù),。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴,，形成包含單個細(xì)胞的液滴,，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光,，經(jīng)探測器檢測,，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理,，輸出統(tǒng)計結(jié)果,，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%（圖2-24）,。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液,，所用儀器稱為流式細(xì)胞計（flow cytometer）。

用流式細(xì)胞計分選細(xì)胞

三,、細(xì)胞電泳

在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷,，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞電泳（cell electrophoresis）,。引起細(xì)胞電泳的電位值稱為ξ電位,。各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同,。在恒定的電場條件下,，同種細(xì)胞的電泳速度相當(dāng)穩(wěn)定，因而可通過測定電泳速度來推算出細(xì)胞的ξ電位,。ξ電位常因細(xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異,，因此在診斷疾病上有一定價值,。此外由于不同類型的細(xì)胞在電場中的泳動速度不同，細(xì)胞電泳尚可用來分離不同種類的細(xì)胞,，例如可把淋巴樣細(xì)胞與造血細(xì)胞分開,。