英文名稱：antiserum 

抗血清是一種含有多克隆抗體的血清,。通過注射抗血清可以傳遞被動(dòng)免疫（passive immunity）治療許多疾病,。目前唯一能夠治療埃博拉病毒患者的方法就是通過注射前一個(gè)患者的抗血清到體內(nèi)。

1,、動(dòng)物的選擇

羊,、馬、雞,、猴,、豚鼠、兔都是常用的免疫動(dòng)物,，在實(shí)驗(yàn)中,，選擇動(dòng)物時(shí)應(yīng)考慮抗原與動(dòng)物的種屬關(guān)系、抗原性質(zhì)與動(dòng)物種類,、免疫血清的需要量,、免疫血清的要求以及動(dòng)物個(gè)體等因素。免疫用動(dòng)物應(yīng)選適齡,、健壯．最好為雄性,。最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是家兔，一般選擇選擇年齡在6個(gè)月以上當(dāng)年繁殖的♂性,，體重2 ～3公斤,，健康家兔三只，免疫前用金屬編號(hào)牌固定兔耳,，或用染料涂沫在動(dòng)物的背部,，作出明確的標(biāo)記。

2,、抗原制備

1）抗原稀釋：用滅菌生理鹽水將抗原稀釋為2mg/ml,，于免疫前一天加入青霉素溶液，使每毫升抗原溶液含青霉素1000 UI,，鏈霉素1000 UI,，放4℃過夜（一般可不加青,、鏈霉素）次日取出，與佐劑混合制成乳劑后用于動(dòng)物免疫,。

免疫原的注射劑量應(yīng)考慮其抗原性的強(qiáng)弱,、分子量大小、動(dòng)物的個(gè)體狀態(tài)和免疫時(shí)間,。對(duì)于純的可溶性抗原的免疫劑量,，通常小鼠首次抗原劑量為50～100μg/次，大鼠為100～200μg/次,，兔為100μg ～1 mg/次,，合成免疫原為2 mg(半抗原約為20～200μg)，一般需要與等量的福氏完全佐劑混合,。加強(qiáng)免疫的劑量為首次計(jì)量的1/2,，通常用不完全福氏佐劑或不用佐劑。如需制備高度特異性的抗血清,，可選用低劑量抗原短程免疫法,；反之，欲獲得高效價(jià)的抗血清,，宜采用大劑量抗原長程免疫法,。

2）佐劑和抗原乳劑的配制

1佐劑的配制：福氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant），各實(shí)驗(yàn)室的配方不盡相同,，我室采用的配方如下：

醫(yī)用液體石臘         20毫升

羊毛脂               12克

水浴溶化,、混勻，分裝于青霉素小瓶,，用紗布,、線繩扎緊瓶塞。8磅20分鐘滅菌,，4℃保存?zhèn)溆?。于免疫前?zhǔn)備抗原乳劑制備時(shí)，以活卡介苗（有時(shí)亦用死卡介苗）代替死結(jié)核菌,，每毫升試劑中加入10mg活卡,，即為福氏完全佐劑。

2抗原乳劑的制備：其方法一般有兩種,，其一,，將等量的完全佐劑（注意佐劑必須預(yù)先加熱融化，但不超過50℃）和抗原溶液分別吸入兩個(gè)5ml注射器內(nèi),，在兩個(gè)注射器的12# 針頭間套上一根長約8～12cm的醫(yī)用無毒塑料管,，將兩個(gè)注射器連接在一起（塑料管必須先經(jīng)酒精浸泡消毒，使用時(shí)取出,，用滅菌生理鹽水沖洗后,，與注射器針頭相連接,，塑料管與針頭的口徑須合適，不能松,，稍緊些為宜）,，針頭插進(jìn)塑料管約1～2cm然后由兩人相對(duì)而坐后緩緩?fù)苿?dòng)針蕊，使管內(nèi)溶液進(jìn)入塑料管道至對(duì)側(cè)注射器內(nèi),，每次推動(dòng)針蕊時(shí)必須把管內(nèi)容物全部推出,，另一側(cè)也同樣操作,，使管內(nèi)液體往返混合,，直至形成油包水乳劑（Water-in-oil enulsion）為止。

其二是,，將等量的佐劑和抗原溶液倒入缽內(nèi),，經(jīng)過反復(fù)碾磨，也可形成油包水乳劑,，該法主要優(yōu)點(diǎn)是快速,，可靠，不足方面主要是由于粘附過多,，浪費(fèi)佐劑及抗原,。

制成的乳劑是否形成油包水乳劑直接影響免疫效果，因此,，必須進(jìn)行質(zhì)量檢查,，檢查的方法是將制成的乳劑滴一滴在涼水（自來水）表面，質(zhì)量合格的乳劑滴入水面保持滴珠完整而不分散,，不合格者進(jìn)入水面后立即擴(kuò)散,，水面油亦逐漸擴(kuò)大，這就必須要繼續(xù)操作至質(zhì)量合格為止,。

但有時(shí),，由于佐劑的配制質(zhì)量原因，很難乳化至合格,，遇有這種情況,，須考慮重新配制佐劑。

3,、免疫途徑,，劑量和免疫周期

抗原注射途徑可根據(jù)不同抗原及試驗(yàn)要求，選用皮內(nèi),、皮下,、肌肉、靜脈或淋巴結(jié)內(nèi)等不同途徑注入抗原進(jìn)行免疫,。一般常采用背部,、足掌,、淋巴結(jié)周圍、耳后等處皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射,。初次免疫與第二次免疫的間隔時(shí)間多為2～4周,。常規(guī)免疫方案為抗原加CFA皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行基礎(chǔ)免疫；再以免疫原加IFA作2～5次加強(qiáng)免疫,，每次間隔2～3周,，皮下或腹腔注射加強(qiáng)免疫。

1）常規(guī)（皮內(nèi)多點(diǎn)注射）免疫：

1第一次免疫：劑量為每只兔子注射1.0 ml抗原乳劑（含抗原量1～2mg）,。注射部位為兩只后腳掌的皮內(nèi)各注射0.2 ml,，其余0.6 ml分多點(diǎn)注入脊柱二側(cè)，頸部,，腹股溝和腋窩等處淋巴結(jié)附近部位皮內(nèi),，每點(diǎn)可注入0.05ml，分12點(diǎn)注入,。

2第二次免疫：初次免疫后20天左右,，劑量為1.0ml/只（1～2 mg/ml），加福氏不完全佐劑,。注射部位在腹部皮下多點(diǎn)注射,，每點(diǎn)注入0.1 ml。

3第三次免疫：再次免疫后兩周內(nèi)進(jìn)行,，注射劑量和部位同第二次免疫,，免疫后7～14d抽取少許靜脈血，分離血清,，試血測(cè)定效價(jià),。

2）淋巴結(jié)免疫：主要優(yōu)點(diǎn)是可減少抗原用量。過程如下：

1卡價(jià)苗致敏：免疫前足掌皮下每側(cè)各注入活卡價(jià)苗（75 mg/ml）0.3 ml,。10天左右觀察兩側(cè)腘窩淋巴結(jié),，一般可腫脹如蠶豆大小，此時(shí)即可進(jìn)行淋巴結(jié)內(nèi)免疫注射,。

2第一次免疫：用手指定淋巴結(jié)后在兩側(cè)腘窩淋巴結(jié)內(nèi)各注入抗原乳劑0.25ml,，每只兔總量0.5 ml；為加強(qiáng)免疫,，于初次免疫20天后,，于腹部皮下多點(diǎn)注射不加佐劑抗原溶液1mg/1ml。

3二周后可如同第一次免疫的劑量和途徑再注射一次,，一般可在第三次免疫注射前試血滴定效價(jià),，效價(jià)如已達(dá)到要求可不必進(jìn)行第三次免疫。

有條件的情況下,，免疫后要加強(qiáng)動(dòng)物飼料管理,，如給熟黃豆飼養(yǎng)等,。

3）腹腔免疫：一般不必加佐劑，適用于細(xì)胞性或顆粒性抗原,，而且抗原性較強(qiáng)者,，例如用綿羊紅細(xì)胞免疫家兔或小鼠即可用此法。

4,、試血,，測(cè)定抗體效價(jià)

 一般在第三次免疫后7～10天即可于兔耳靜脈或小鼠尾尖取少量血，分離出血清之后進(jìn)行試血,。

① 環(huán)狀試驗(yàn),，較為經(jīng)典的方法，目前較少采用,，如與20μg/ml以下的抗原于30 min內(nèi)能出現(xiàn)“艸”的沉淀環(huán),，即測(cè)定抗體效價(jià)達(dá)1：5000以上時(shí)為合格,。

② 免疫雙擴(kuò)散法,，這是最常用的試血方法，其具體方法是,，中間孔加稀釋的抗原（1mg/ml）10μl,，周圍孔順時(shí)針方向加制備的抗血清分別為1:2, 1:4, 1:8，1:16,，1:32和1:64,，（用生理鹽水或PBS稀釋）。經(jīng)37℃保溫24h后觀察結(jié)果,，效價(jià)在1:16以上即可決定放血,。

5、放血

 經(jīng)效價(jià)檢查合格后即可放血,。放血前動(dòng)物應(yīng)停食12 h,，以減少血清中的脂肪含量。如擬保留該免疫動(dòng)物,，可直接由心臟取血,，或切開耳緣靜脈滴血或心臟穿刺取血。取血后由靜脈緩緩注入等量5%葡萄溶液以補(bǔ)足失血量,。取血的動(dòng)物經(jīng)2～3個(gè)月休息,，可再次加強(qiáng)免疫后取血。如擬一次放血致死,，可用頸動(dòng)脈放血的方法,，各種取血方法如下。

1）心臟取血：固定動(dòng)物于仰臥位置,，用食指探明心臟博動(dòng)量高部位（在胸骨左側(cè),，由下向上數(shù)第3與第4助骨之間,，指兔），剪去少許毛,，用2.5% 碘酒和75%酒精消毒后,，以9#針頭在預(yù)定位置與胸部呈45。角刺入心臟,，微微上下移動(dòng)針頭,，待見血液進(jìn)入針筒后，即將注射器位置固定取血,。2.5公斤體重的家兔一次可取血20～30ml,。

2）耳緣靜脈滴血：先將耳緣靜脈附近的毛剪去用無菌棉球?qū)?a class="innerlink" title="皮膚" jquery1321173138031="27">皮膚擦干凈（不用酒精消毒，避免溶血）,。用臺(tái)燈照射耳部使血管因溫度增高而擴(kuò)張,，然后用無菌刀片將耳緣靜脈切一長0.5cm的縱切口，第一次切口應(yīng)從耳尖部開始,，以后再切時(shí),，逐步向耳根方向移動(dòng)。用無菌試管或平皿收集流出的血液,。如切口凝血,，血流不暢時(shí)，可用無菌棉棒輕輕將切口外血凝塊擦去（注意勿使切口損傷太大）,，血流仍可繼續(xù)流出,，直至達(dá)到所需要的血量為止。取血后用無菌棉球壓迫切口止血,。耳緣靜脈取血一次可取血50ml左右而動(dòng)物不死,。

3）頸動(dòng)脈放血：使動(dòng)物仰臥固定四肢，頸部剪毛,、消毒后縱向切開前頸部皮膚長約10cm,，用止血鉗將皮膚分開夾住，剝離皮下組織,，露出肌層,，用刀柄加以分離，即見搏動(dòng)的頸動(dòng)脈,。小心將頸動(dòng)脈和迷走神經(jīng)剝離長約5cm,，選擇血管中段，用止血鉗夾住血管壁周圍的筋膜,。遠(yuǎn)心端用絲線結(jié)扎,，近心端用動(dòng)脈鉗夾住，用酒精棉花球消毒血管周圍，用無菌剪刀剪一V形缺口,。取長2.5cm,、直徑為1.6mm塑料管一段，將一端剪成針頭樣斜面,，并將此端插入頸動(dòng)脈中,，另一端放入200ml無菌三角瓶內(nèi)，然后放開止血鉗,，血即流入三角瓶內(nèi),，動(dòng)物流血至死，2.5公斤家兔可放血80～100ml,。

6,、分離血清

必須在無菌條件下進(jìn)行，待收集于平皿或三角瓶內(nèi)的血液凝固之后,，用無菌滴管在無菌環(huán)境（例如超凈工作臺(tái)）中把血塊與瓶壁剝離后,，放入37℃，1～2h取出后放入4℃過夜,，使血清充分析出（不能冰凍,，否則產(chǎn)生溶血），經(jīng)離心沉淀分出血清,，放進(jìn)低溫冰箱保存,。使用前必須經(jīng)過簽定合格后再分裝保存?zhèn)溆谩?

7、抗血清的保存

 1）經(jīng)簽定合格后的抗血清,，以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的疊氮鈉，使其最后濃度分別為0.01%或0.05%,。

2）用無菌滴管將抗血清分裝小管,，每管裝1ml左右。

3）-20℃以下保存,，可保存2年以上,。

4）如有條件可將血清冷凍干燥保存于4℃以下，保存時(shí)間更久

 1,、動(dòng)物的免疫反應(yīng)存在著個(gè)體差異,，甚至有人報(bào)告不同品種動(dòng)物一次免疫后產(chǎn)生的抗體的差別可高達(dá)500倍，所以制備抗血清時(shí)不能只免疫一只動(dòng)物,，一般最好免疫3～4只,，因?yàn)橛械膭?dòng)物可能產(chǎn)生抗體效價(jià)很低或不產(chǎn)生抗體，免疫反應(yīng)好的動(dòng)物所能提供的抗體往往高于一般動(dòng)物3～4倍,。

2,、為制備單價(jià)特異性高的抗血清，所用抗原純度越高越好，因此,，在純化抗原過程中應(yīng)盡量除去可能存在的雜蛋白,，這樣可以省去許多時(shí)間來吸收抗血清中的非特異性抗體。

3,、要制備高效價(jià)的抗體,，必須要加佐劑（一般采用完全福氏佐劑），加佐劑后免疫動(dòng)物,，抗體效價(jià)至少可增加5倍,。但也應(yīng)考慮到，如果抗原中有微量的雜蛋白存在,，即使0.005mg,，亦可因有佐劑而產(chǎn)生非特異性的抗體，所以要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和抗原的純度適當(dāng)?shù)厥褂米魟?

4,、制成的抗原乳劑是否為油包水乳劑應(yīng)進(jìn)行檢查,，否則會(huì)影響免疫效果，如不是油包水乳劑,，應(yīng)重新制備,。

5、當(dāng)抗原量過少不易提純時(shí),，可采用抗原抗體在瓊脂擴(kuò)散中形成的沉淀線直接免疫動(dòng)物制備抗體,。

6、抗血清效價(jià)一般以抗血清稀釋倍數(shù)表示,。血清效價(jià)的檢測(cè)方法很多,，靈敏度各不同，因此在表示抗血清效價(jià)時(shí),，應(yīng)標(biāo)明檢測(cè)方法,。另外，在沉淀反應(yīng)中,，出現(xiàn)沉淀時(shí)的抗原,、抗體比例有一較大的范圍，如用不同濃度的抗原測(cè)定效價(jià)時(shí),，結(jié)果會(huì)因此有別,，所以在測(cè)定抗血清效價(jià)時(shí)，需注意抗原的濃度,。

7,、分裝保存的抗血清應(yīng)注明抗血清的名稱，效價(jià),，制備日期以及包裝量,。^[1]