細(xì)菌生理生化試驗(yàn)
微生物生理生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生理生化反應(yīng)常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)分的微生物,。因此微生物生理生化反應(yīng)是微生物分類(lèi)鑒定中的重要依據(jù)之一,微生物鑒定中常用的生理生化反應(yīng)如下所示：
(一) 糖,、醇發(fā)酵試驗(yàn)
原理：
不同微生物分解利用糖類(lèi)的能力有很大差異，或能利用或不能利用,，能利用者,，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn),。有些細(xì)菌分解某些糖（醇、苷）產(chǎn)酸（符號(hào)：+）,、產(chǎn)氣（符號(hào)：○）,，培養(yǎng)基由紫（藍(lán)）變黃（指示劑溴甲酚紫或溴百里酚藍(lán)由紫或藍(lán)遇酸變黃的結(jié)果），并有氣泡,；有些產(chǎn)酸,，僅培養(yǎng)基變黃；有些不分解糖類(lèi)（符號(hào)：－）,，培養(yǎng)基仍為紫（藍(lán)）色,。
培養(yǎng)基配制：
一般細(xì)菌常用休和李夫森二氏培養(yǎng)基：
蛋白胨：2g ，K2HPO4 :0.2g ,，NaCl:5g ,，糖（醇、糖苷）：1% ,，水洗瓊脂：5～6g,，蒸餾水：1000mL，PH:6.8～7.0,，溴百里酚藍(lán)：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后,，再加水配成1%水溶液)。先調(diào)PH后再加指示劑,。
芽孢桿菌培養(yǎng)基配制：
(NH4)2HPO4:1g ,，MgSO4:0.2g ，KCl:0.2g ,，酵母膏：0.2g ,，糖（醇、糖苷）：1%水洗瓊脂：5～6g ,，蒸餾水：1000mL ,，溴甲酚紫：0.4%乙醇液2mL,，PH:6.8～7.0。先調(diào)PH后再加指示劑,。
將以上培養(yǎng)基分裝試管,，培養(yǎng)基高度約為4～5cm ，115℃滅菌20min,。
測(cè)定的糖（醇,、糖苷）類(lèi)可以包括：葡萄糖、蔗糖,、甘露糖,、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）,、D-山梨醇,、果糖、阿拉伯糖,、麥芽糖,、纖維二糖、木糖,、水楊苷等,。
注意：以上亦可用液體培養(yǎng)基。
接種和觀察結(jié)果：
用18～24h的幼齡菌種,，用穿刺針接種于培養(yǎng)基中,，適溫培養(yǎng)1d，3d,，5d后觀察,，顏色變黃為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮?；有氣泡產(chǎn)生為產(chǎn)氣,。
結(jié)果記錄：
產(chǎn)酸：+，產(chǎn)氣：○,，不產(chǎn)酸長(zhǎng)氣：- ,。
(二) 淀粉水解試驗(yàn)
原理：
某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖,。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色,?！?/span>
培養(yǎng)基配制：
牛肉膏5g；NaCl:5g,；可溶性淀粉5g,；瓊脂:20g；蒸餾水1000mL。PH:7.2
121℃滅菌20min,。
試驗(yàn)方法：
以18~24h的純培養(yǎng)物,，點(diǎn)接于淀粉瓊脂平板（一個(gè)平板可分區(qū)接種）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1℃培養(yǎng)24～48h,，或于20℃培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物,，則加數(shù)滴碘試劑于試管中,。立即檢視結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色,、菌落或培養(yǎng)物周?chē)霈F(xiàn)無(wú)色透明圈,、或肉湯顏色無(wú)變化。陰性反應(yīng)則無(wú)透明圈或肉湯呈深藍(lán)色,。
淀粉水解系逐步進(jìn)行的過(guò)程,，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時(shí)間,，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系,。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適,。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱,，因而以臨用時(shí)制備為妥。
結(jié)果記錄：分解：+,，不分解：-,。
(三) V-P試驗(yàn)
原理：
菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合,，脫羧成乙酰甲基甲醇,，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰,，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物,，稱(chēng)V－P（+）反應(yīng)。
培養(yǎng)基配制方法：
蛋白胨5g,；葡萄糖5g,；NaCl(K2PO4):5g；蒸餾水：1000mL,；PH:7.0～7.2,，分裝試管，毎管裝約4～5cm,，115℃滅菌20min,。
試劑：40%NaOH(或KOH),，a-萘酚。
試驗(yàn)方法：
將試驗(yàn)菌接種于上述培養(yǎng)基,，于36±1°C培養(yǎng)4天,、培養(yǎng)液2.5ml先加入a萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動(dòng)2～5min,，陽(yáng)性菌常立即呈現(xiàn)紅色,，若無(wú)紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱,，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色,、可判定為陰性。
結(jié)果記錄：陽(yáng)性：+,，陰性：- ,。
(四) 甲基紅（Methyl Red）試驗(yàn)
原理：
有些細(xì)菌能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸,，進(jìn)一步分解中,，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸,，琥珀酸,、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下,，使甲基紅指示劑變紅,。
培養(yǎng)基配制方法：
與V-P試驗(yàn)培養(yǎng)基一致。
試劑：甲基紅:0.1g,，95%乙醇：300mL,，蒸餾水：200mL。
試驗(yàn)方法：
挑取新的待試純培養(yǎng)物少許,，接種于通用培養(yǎng)基,，培養(yǎng)于36±1°C或30°C（以30°C較好）3～5天，從第二天起,，每日取培養(yǎng)液1ml,，加甲基紅指示劑1～2滴，陽(yáng)性呈鮮紅色,，弱陽(yáng)性呈淡紅色,，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性或至第5天仍為陽(yáng)性,、即可判定結(jié)果,。
結(jié)果記錄：陽(yáng)性：+，陰性：- ,。
(五) 菌膜形成試驗(yàn)
有些菌在液體培養(yǎng)基中能形成菌膜,，利用這一特征可進(jìn)行不同細(xì)菌的區(qū)別。
培養(yǎng)基配制方法：蛋白胨：5g,；氯化鈉：5g,；牛肉膏：10g；蒸餾水：1000mL,；pH ：7.2,。121℃滅菌15～30min。
試驗(yàn)方法：接種后于30℃培養(yǎng)24小時(shí),，觀察培養(yǎng)物是否有菌膜形成,，有菌膜為陽(yáng)性。
(六) 明膠（Gelatin）液化試驗(yàn)
原理：
有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱(chēng)類(lèi)蛋白水解酶）,，能將明膠先水解為多肽,，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化,?！ ?/span>
培養(yǎng)基配制方法：蛋白胨：5g，明膠：120g,，蒸餾水：1000mL,。PH:7.2～7.4，分裝試管,，毎管裝約4～5cm,，115℃滅菌20min。
試驗(yàn)方法：
挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物,，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度,。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃,。每天觀察結(jié)果,，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后,、再觀察其是否被細(xì)菌液化,，如確被液化，即為試驗(yàn)陽(yáng)性,。否則為陰性,。
(七) 尿酶（Urease）試驗(yàn)
原理：
有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解,、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨,，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色,。尿素酶不是誘導(dǎo)酶,，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖?，?xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0,。
培養(yǎng)基配制方法：
蛋白胨：1 g ,；NaCl：5 g ；KH2PO4 ：2 g ,；葡萄糖 1 g ,；瓊脂：15 g；酚紅：0.012g,；蒸餾水 1000 ml,。
除酚紅外，溶解上述成分,，并調(diào)節(jié)PH為6.8～6.9,，然后加入酚紅指示劑，使培養(yǎng)基呈橙黃色,，分裝,，115℃滅菌20min。待培養(yǎng)基冷至50℃左右,，加入預(yù)先過(guò)濾除菌的20%尿素水溶液,，使其終濃度為2%。
試驗(yàn)方法：
挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量穿刺接種于瓊脂斜面,，不要到達(dá)底部,，培養(yǎng)1～4d觀察結(jié)果，如為陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)一下,，作最終判定,，變?yōu)榉奂t色為陽(yáng)性。
(八) 氧化酶（Oxidase）試驗(yàn)
原理：
氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶,，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶,，氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化,，產(chǎn)生顏色反應(yīng),。
試劑：
試驗(yàn)方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽(yáng)性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色,，Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色,。陰性者無(wú)顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果,。
(九) 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)(觸酶試驗(yàn))
具有過(guò)氧化氫酶的細(xì)菌,，能催化過(guò)氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。
方法：直接滴加3％過(guò)氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)物中,，立即觀察,，有大量氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性,。
(十) 精氨酸脫羧基酶試驗(yàn)
培養(yǎng)基：
K2HPO4: 1.0g
NH4Cl: 1.0g
MgSO4: 0.2g
酵母膏： 0.2g
葡萄糖： 1.0g
DL-精氨酸： 1.0g
1.6%溴甲酚紫： 1mL
H2O: 1000mL
pH: 6.7-6.8
分裝試管,，115℃滅菌30min,。
接種后置30℃培養(yǎng)24h,，紫色者為陽(yáng)性，呈黃色者為陽(yáng)性,。
(十一) 卵磷脂酶試驗(yàn)：
培養(yǎng)基：
蛋白胨： 10g
酵母膏： 3g
NaCl: 5g
瓊脂： 20g
H2O: 1000mL
pH: 7.0-7.2
分裝三角瓶,，121℃滅菌30min。
用75%乙醇將新鮮雞蛋表面消毒,，并用經(jīng)火焰滅菌的鑷子將雞蛋打一個(gè)孔,，傾去蛋清，然后用5mL無(wú)菌吸管吸出卵黃,，加入到融化后冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基中,，使卵黃含量為培養(yǎng)基總體積的2-3%,，混勻后倒平板，點(diǎn)接菌種,，30℃培養(yǎng)24h后觀察,，菌落邊緣出現(xiàn)渾濁圈者為卵磷脂酶陽(yáng)性。
(十二) 蛋白質(zhì)水解試驗(yàn)：（即明膠水解試驗(yàn)）
培養(yǎng)基：
牛肉膏： 5.0g
蛋白胨： 1.0g
明膠： 4.0g
葡萄糖： 1.0g
NaCl： 5.0g
K2HPO4: 0.5g
KH2PO4: 0.5g
瓊脂： 20g
H2O: 1000mL
分裝三角瓶,，121℃滅菌30min,。
將培養(yǎng)基融化后倒平板，并點(diǎn)接菌種,，30℃培養(yǎng)2d,，用酸性升汞溶液傾注于平板表面,，如果菌落周?chē)霈F(xiàn)透明圈，則為陽(yáng)性,。
(十三) 七葉苷試驗(yàn)（七葉靈試驗(yàn)）：
培養(yǎng)基：
牛肉膏： 10g
七葉靈： 5g
瓊脂： 20g
H2O： 1000mL
pH: 自然
分裝三角瓶,，121℃滅菌30min,。
另配5%FeCl3水溶液，單獨(dú)滅菌,。培養(yǎng)基融化后,，先將每個(gè)平板加上FeCl3溶液二滴，然后倒培養(yǎng)基混勻,，凝固后點(diǎn)接菌種,，30℃培養(yǎng)2-3d觀察,。菌苔周?chē)霈F(xiàn)深褐色區(qū)者為陽(yáng)性反應(yīng)。
(十四) Tween 80試驗(yàn)：
培養(yǎng)基：
蛋白胨： 10g
NaCl: 5g
CaCl2: 0.1g
瓊脂： 9g
H2O: 1000mL
分裝三角瓶，121℃滅菌20min,。
冷卻至50℃,，加入Tween 80至終濃度體積分?jǐn)?shù)為1%，倒平板,，點(diǎn)接測(cè)試菌,，35℃培養(yǎng)7d。有暈圈者為陽(yáng)性,。
(十五) 水楊苷試驗(yàn)：
培養(yǎng)基:
K2HPO4: 1.0g
NH4Cl: 1.0g
MgSO4: 0.2g
酵母膏： 0.2g
1.6%溴甲酚紫： 1mL
H2O: 1000mL
pH: 7.0-7.2
水楊苷： 5.0g
分裝試管,，115℃滅菌30min。
接種后置30℃培養(yǎng),，培養(yǎng)基變黃者為糖發(fā)酵陽(yáng)性,。
(十六) 實(shí)施幾丁質(zhì)利用實(shí)驗(yàn)：
膠體幾丁質(zhì)： 10.0g
蛋白胨： 3.0g
MgSO4: 0.5g
FeSO4: 0.01g
KH2PO4: 0.3g
K2HPO4: 0.7g
ZnSO4： 0.001g
瓊脂： 20g
pH: 7.2-7.4
H2O: 1000mL
分裝三角瓶，121℃滅菌15-30min,。
冷卻至50℃倒平板,，點(diǎn)接菌種，30℃培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間,，能生長(zhǎng)并且在菌落周?chē)纬赏该魅Φ臑殛?yáng)性,。
膠體幾丁質(zhì)的制備：
稱(chēng)取5g幾丁質(zhì)加20mL丙酮，100mL濃鹽酸,，在4℃下電磁攪拌24h,，使幾丁質(zhì)充分溶解。然后用玻璃纖維過(guò)濾到500mL的去離子冰水中，同時(shí)攪拌,，用離心的方法將其洗至pH值近中性,，最后加適量去離子水高壓滅菌后保存。
(十七) 精氨酸脫羧基酶試驗(yàn)
培養(yǎng)基：
K2HPO4: 1.0g
NH4Cl: 1.0g
MgSO4: 0.2g
酵母膏： 0.2g
葡萄糖： 1.0g
DL-精氨酸： 1.0g
1.6%溴甲酚紫： 1mL
H2O: 1000mL
pH: 6.7-6.8
分裝試管,，115℃滅菌30min,。
接種后置30℃培養(yǎng)24h，紫色者為陽(yáng)性,，呈黃色者為陽(yáng)性,。
(十八) 卵磷脂酶試驗(yàn)：
培養(yǎng)基：
蛋白胨： 10g
酵母膏： 3g
NaCl: 5g
瓊脂： 20g
H2O: 1000mL
pH: 7.0-7.2
分裝三角瓶，121℃滅菌30min,。
用75%乙醇將新鮮雞蛋表面消毒,，并用經(jīng)火焰滅菌的鑷子將雞蛋打一個(gè)孔，傾去蛋清,，然后用5mL無(wú)菌吸管吸出卵黃，加入到融化后冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基中,，使卵黃含量為培養(yǎng)基總體積的2-3%,，混勻后倒平板，點(diǎn)接菌種,，30℃培養(yǎng)24h后觀察,，菌落邊緣出現(xiàn)渾濁圈者為卵磷脂酶陽(yáng)性。
(十九) 蛋白質(zhì)水解試驗(yàn)：（即明膠水解試驗(yàn)）
培養(yǎng)基：
牛肉膏： 5.0g
蛋白胨： 1.0g
明膠： 4.0g
葡萄糖： 1.0g
NaCl： 5.0g
K2HPO4: 0.5g
KH2PO4: 0.5g
瓊脂： 20g
H2O: 1000mL
分裝三角瓶,，121℃滅菌30min,。
將培養(yǎng)基融化后倒平板，并點(diǎn)接菌種,，30℃培養(yǎng)2d,，用酸性升汞溶液傾注于平板表面，如果菌落周?chē)霈F(xiàn)透明圈,，則為陽(yáng)性,。
(二十) 七葉苷試驗(yàn)（七葉靈試驗(yàn)）：
培養(yǎng)基：
牛肉膏： 10g
七葉靈： 5g
瓊脂： 20g
H2O： 1000mL
pH: 自然
分裝三角瓶，121℃滅菌30min,。
另配5%FeCl3水溶液,，單獨(dú)滅菌。培養(yǎng)基融化后,，先將每個(gè)平板加上FeCl3溶液二滴,，然后倒培養(yǎng)基混勻，凝固后點(diǎn)接菌種,，30℃培養(yǎng)2-3d觀察,。菌苔周?chē)霈F(xiàn)深褐色區(qū)者為陽(yáng)性反應(yīng)。
