一．農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備 （同大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提?。缓髮⑵滢D(zhuǎn)化大腸桿菌,，再提取大腸桿菌的質(zhì)粒DNA進行酶切鑒定。

取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml鏈霉素平板劃線,，28℃培養(yǎng)2天,。挑單菌落接種于5ml YM（0.5g/L KH₂ PO₄ ,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2 g/L NaCL,0.2 g/L MgSO₄ ,0.3 g/L Yeast extract,PH₇.0）液體培養(yǎng)基中，220rpm，28℃振蕩培養(yǎng)18 hr 左右,。將5ml菌液轉(zhuǎn)接于100ml YM液體培養(yǎng)基中,，28℃,220rpm,振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀ =0.5。轉(zhuǎn)入無菌1.5ml的EP管,，5000g離心5min,去上清液,。加入1ml預(yù)冷的0.1M的CaCl₂ 溶液，輕輕懸浮細胞,，冰上放置20min,，4℃下，5000g離心5min,，去上清,。加入200µl預(yù)冷的含15%甘油的0.1M的CaCl₂ 溶液，輕輕懸浮,?；靹蚝罅⒓磧龃嬗?80℃。

二． 雙元載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105

取1µg左右的質(zhì)粒DNA加入到200µl EHA105感受態(tài)細胞中,，混勻后,，冰浴30min；-70℃放置10min ,；取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min,；冰浴2min；加入800µl YM液體培養(yǎng)基,28℃,，175rpm搖培3hr,；取出后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上，28℃培養(yǎng)到形成單菌落,。

三． 桿菌轉(zhuǎn)化子的鑒定

A．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50µg/ml Kanamycin的YM液體培養(yǎng)基中,，28℃，220rpm搖培16hr,，直接用菌液做PCR,。PCR反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)組分 體積 終濃度 母液濃度

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌液 2µl

P1 (35S) 2µl 200nM 2µM

P2 (GUS) 2µl 200nM 2µM

10 ×PCR Buffer 2µl

Mg²⁺ 1.2µl 1.5mM 25mM

d NTP 1.2µl 150µM 2.5mM

Taq酶 0.2µl 1U 5U/µl

H₂O 9.4µl

20µl

PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：94℃預(yù)變性3min 后開始以下循環(huán)反應(yīng)：94℃變性30秒，50℃退火1min ,，72℃延伸1min,，35個循環(huán)后，72℃延伸10min,。反應(yīng)結(jié)束后,，取10µl反應(yīng)液在1.0 %瓊脂糖凝膠中電泳擴增產(chǎn)物。

B．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的酶切鑒定

提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA（同大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提?。?，然后將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌,，再提取大腸桿菌的質(zhì)粒DNA進行酶切鑒定。

NA